核糖核酸酶保护实验(Ribonuclease protection assay,RPA)基本原理是将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交,标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合,形成双链RNA;未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸,而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA,免受RNA酶的消化。对于32P标记的探针,杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳,用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号; 对于生物素标记的探针,杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜,采用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合,X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。

与Northern杂交相比,核糖核酸酶保护实验灵敏度更高;由于没有PCR扩增的步骤、避免了PCR扩增造成的偏移,可以更准确的反应RNA的丰度;在一个反应体系中可以同时检测多个指标。

完整的RPA实验包括探针的制备/标记、杂交、RNaseA 消化、变性聚丙酰胺凝胶电泳和信号检测等步骤。具体操作如下:

一、探针的制备/标记

探针的制备一般使用体外转录的方法进行。

1.载体构建及PCR

构建含有探针序列的质粒。

设计含有T7或SP6启动子的PCR引物,注意:PCR产物是探针的模板,所以启动子序列在下游引物中。

2.体外转录

利用体外转录体系,以PCR产物为模板,合成探针。常用的体外转录体系如下:

4 ul  5倍转录缓冲液

2 ul  0.1 M DTT

4 ul  2.5 mM NTP(A,C,G)

0.8 ul RNA酶抑制剂(25 U/ μl)(Promega)

100 μM 标记UTP(32P)

1 ul RNA聚合酶SP6,T7或T3

总体积 20 ul。

孵育1小时,37℃。

二、杂交

1.探针纯化

可以使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸去除试剂盒或Boehringer离心柱(G50葡聚糖凝胶)进行。

2.杂交

RNA提取后溶于杂交缓冲液,调整浓度为1μg/μL,8μL RNA中加入2μL探针,95℃变性5分钟,40-55℃孵育4小时(孵育温度根据探针的溶解温度确定)。

3.消化

1)加入RNAse消化液,37℃保温30分钟。

2)加入10%的SDS10μL,蛋白酶K(10μg/μL)20μL,37℃保温10分钟。

3)苯酚-氯仿抽提,取上清。

4)异丙醇或无水乙醇沉淀RNA。

5)洗涤、溶解沉淀。

三、聚丙酰胺凝胶电泳

电泳方法同常规的SDS-PAGE电泳。

四、检测

放射自显影检测。

注:探针也可采用非放射性标记(如:生物素标记),那么随后的检测也需要按照非放射性标记的流程进行。

探针 方法一 方法二 方法三

在一个反应体系中使用了6种探针,3种不同的实验方法进行实验,每一种方法重复3次(Tam Thuan Nguyen , Jeffrey B Smith.2002)

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