nterleukin 10 (IL-10) is an anti-inflammatory cytokine that plays a critical role in the control of immune responses. However, its mechanisms of action remain poorly understood. Here, we show that IL-10 opposes the switch to the metabolic program induced by inflammatory stimuli in macrophages. Specifically, we show that IL-10 inhibits lipopolysaccharide-induced glucose uptake and glycolysis and promotes oxidative phosphorylation. Furthermore, IL-10 suppresses mammalian target of rapamycin (mTOR) activity through the induction of an mTOR inhibitor, DDIT4. Consequently, IL-10 promotes mitophagy that eliminates dysfunctional mitochondria characterized by low membrane potential and a high level of reactive oxygen species. In the absence of IL-10 signaling, macrophages accumulate damaged mitochondria in a mouse model of colitis and inflammatory bowel disease patients, and this results in dysregulated activation of the NLRP3 inflammasome and production of IL-1β.

白细胞介素10 (IL-10) 是一种抗炎细胞因子，在控制免疫反应中发挥着关键作用。然而，其作用机制仍知之甚少。在这里，我们发现 IL-10会阻止巨噬细胞中炎症刺激诱导的代谢程序的转变。具体来说，我们发现 IL-10抑制脂多糖诱导的葡萄糖摄取和糖酵解，并促进氧化磷酸化。此外，IL-10通过诱导 mTOR抑制剂DDIT4 来抑制哺乳动物雷帕霉素靶点 (mTOR) 活性。因此，IL-10促进线粒体自噬，从而消除以低膜电位和高水平活性氧为特征的功能失调的线粒体。在缺乏IL-10信号传导的情况下，结肠炎和炎症性肠病患者的小鼠模型中，巨噬细胞会积累受损的线粒体，这会导致NLRP3炎症小体的激活失调和IL-1β的产生。

作者分析了 Il10–/– 骨髓源性巨噬细胞 (BMDM)，了解 LPS 刺激后细胞外酸化率 (ECAR) 和线粒体耗氧率 (OCR) 的变化，分别作为糖酵解和 OXPHOS 的指标。与野生型 (WT) BMDM 相比，Il10–/– BMDM 变得更加糖酵解（即，具有更高的基础 ECAR），但“氧化”程度更低（即，具有更低的基础 OCR）（图 1、A 和 B）。Il10–/– 细胞中 OXPHOS 的减少并不是由于一氧化氮 (NO) 的产生，因为用诱导型一氧化氮合酶抑制剂治疗未能挽救该表型。然而，添加外源性 IL-10 可恢复 Il10–/– 细胞中的 WT 表型（图 1，A 和 B），而用针对 IL-10R α 亚基 (IL-10Rα) 的封闭抗体处理 WT BMDM 导致 ECAR 和 OCR 的变化与 Il10–/– 细胞相似，表明 IL-10 在巨噬细胞中具有自分泌作用。腹腔注射 LPS 的 Il10-/- 小鼠的脾巨噬细胞中也观察到过度的糖酵解。接下来，作者通过测定用寡霉素[三磷酸腺苷 (ATP) 合酶抑制剂]、氰化物对三氟甲氧基苯腙 (FCCP)（H+ 离子载体）和鱼藤酮连续处理细胞期间 OCR 的实时变化来评估线粒体的功能概况 （电子传递链的抑制剂）（图1C）。与 WT BMDM 相比，LPS 刺激后 Il10–/– BMDM 中缺乏外源性 IL-10，导致最大呼吸能力 (MRC) 较低（图 1、C 和 D）。这些结果表明，LPS 刺激后在 Il10–/– BMDM 中观察到的基础 OCR 降低可能是由于线粒体适应性的丧失，如 MRC 降低所表明的。与这一想法一致，LPS 刺激后 Il10–/– BMDM 中的基础细胞 ATP 水平也降低了。

图1

接下来作者思考 IL-10 对糖酵解的抑制是否是由于糖酵解通量的抑制。与之前的研究一致，在 WT BMDM 中，葡萄糖摄取量在 LPS 刺激后 2 小时内增加并达到最大值，并在 12 小时后下降。4 小时时，在 LPS 刺激的 Il10–/– BMDM 中也观察到了葡萄糖摄取（图 1E）。然而，在没有外源IL-10的情况下，LPS刺激12小时后，Il10–/–细胞的葡萄糖摄取维持在较高水平（图1E），这表明IL-10对葡萄糖摄取具有抑制作用。

葡萄糖转运蛋白 GLUT1 在 LPS 刺激期间巨噬细胞的葡萄糖摄取中发挥着重要作用。事实上，作者的 RNA 测序 (RNA-seq) 数据显示 BMDM 在稳定状态下主要表达 Glut1。然而，Glut1 的表达不受 IL-10 的影响。因此，作者思考 IL-10 是否抑制 GLUT1 从细胞内囊泡到细胞表面的易位，这是促进细胞摄取葡萄糖的关键步骤。为了测试这一点，作者用抗体追踪了 GLUT1 的细胞定位，并通过免疫荧光和 ImageStream 分析将其可视化。两项分析均表明，GLUT1 在稳态时主要定位于细胞内囊泡，但在 LPS 刺激后易位至质膜（图 1F）。请注意，外源性 IL-10 抑制了 Il10–/– BMDM 中的 GLUT1 易位（图 1F）。此外，Il10–/– BMDMs 中的 RNA-seq 分析还表明，IL-10 抑制糖酵解途径中编码酶的基因表达，包括 Hk1、Hk3、Pfkp 和 Eno2。总之，这些数据表明 IL-10 通过调节 GLUT1 易位和糖酵解酶的基因表达来抑制糖酵解通量。

为了研究 Il10–/– BMDM 中上述线粒体代谢谱的改变是否是由线粒体功能异常引起的，作者首先用 MitoTracker Green 对细胞进行染色，以检测总线粒体含量，而不考虑线粒体膜电位 (Δψm)，并发现 Il10–/ – 与 WT 巨噬细胞相比，LPS 刺激后 BMDM 线粒体质量增加（图 2A）。这并不是由于细胞大小增加，因为 Il10–/– 细胞的大小与 WT 细胞相似，而是与流式细胞术测量的侧向散射 (SSC) 信号反映的更大的细胞内复杂性相关。然后作者假设 Il10–/– 细胞中线粒体质量的增加可能是由于功能障碍线粒体的积累和 Δψm 的损失所致。为了测试这一点，作者结合使用 MitoTracker Green（Δψm 独立的线粒体染色剂）和 MitoTracker Red（Δψm 依赖的线粒体染色剂）来区分呼吸线粒体和功能障碍线粒体，并且作者观察到功能障碍线粒体的增加 (MitoTracker) LPS 刺激的 Il10–/– BMDM 中（绿色+高，MitoTracker 红色+低）（图 2B）。这与使用四甲基罗丹明甲酯染色观察到的 Δψm 损失一致。这些数据表明，在没有 IL-10 的情况下，LPS 刺激期间会发生功能障碍线粒体的积累。

已知 Δψm 的损失与线粒体 ROS 的积累有关 。因此，作者检查了 Il10–/– BMDM 中 Δψmlow 线粒体的积累是否与线粒体 ROS 的产生相关。为了评估线粒体中的 ROS 水平，作者使用线粒体特异性 ROS 指示剂 MitoSOX 来选择性检测活细胞线粒体中的超氧化物。作者发现，在没有外源性 IL-10 的情况下，LPS 刺激的 Il10–/– 巨噬细胞中 MitoSOX 荧光增强（图 2C），并且与 MitoTracker Green 染色所示的线粒体总质量相关（图 2D），这些发现表明 IL-10 的缺失会导致积累的线粒体产生 ROS。Il10–/– 细胞中产生 ROS 的线粒体的积累也通过使用两种荧光染料的活细胞成像进行可视化（图 2E）。此外，Il10-/-巨噬细胞中ROS的产生是线粒体起源的，因为它可以通过线粒体复合物II抑制剂的处理来阻断。

图2

作者假设功能失调和产生 ROS 的线粒体的积累可能是 LPS 刺激后 Il10–/– 细胞线粒体自噬受损的结果。为了检测线粒体自噬，作者在 LC3-GFP 转基因 (tg) 小鼠产生的 BMDM 中过表达线粒体靶向融合蛋白 (Mito-DsRed)，这些小鼠表达绿色荧光蛋白 (GFP) 标记的 LC3，并观察到 LC3-GFP 的募集增加 LPS 刺激的细胞中的 Mito-DsRed+ 线粒体表明在 LPS 刺激期间诱导了线粒体自噬。为了更准确地确定 IL-10 在线粒体自噬中的作用，作者将 LC3-GFP 转基因小鼠与 Il10–/– 小鼠杂交，产生了 Il10–/– LC3-GFP BMDM。通过测量 LPS 刺激后 LC3-GFP 斑点的形成来评估自噬，如图 2F 所示。正如预期的那样，无论 IL-10 是否缺乏，带有 LC3-GFP 的 Il10+/– 和 Il10–/– BMDM 在用 mTOR 抑制剂雷帕霉素处理后，LC3 斑点的形成增加，已知雷帕霉素会诱导自噬（图 2G）。然而，在没有外源性IL-10的情况下，与对照细胞（即Il10+/–）相比，LPS刺激后Il10–/– LC3-GFP细胞的LC3斑点形成显着降低（图2G），这表明诱导 LPS刺激后巨噬细胞中IL-10的线粒体自噬。与这一想法一致，缺乏 Atg5 的 BMDM 在 OCR 中也表现出显着改变的代谢特征（图 2H）。然而，与 Il10–/– BMDM 不同，添加外源 IL-10 未能恢复 Atg5 缺陷细胞中的 WT 表型（图 2H），这表明 IL-10 对线粒体功能的影响在很大程度上（但可能不完全） 是自噬依赖性的。

mTOR 是关键的代谢调节因子，mTORC1 的激活可控制葡萄糖和脂质代谢并抑制自噬。鉴于观察到 IL-10 对线粒体自噬的影响，作者检查了 IL-10 是否调节 mTORC1 通路的活性。为了支持 mTORC1 可能协调巨噬细胞激活过程中代谢变化的观点，用 LPS 刺激 WT BMDM 导致 mTORC1 激活高于基础水平，如 S6K、S6 和 4E-BP1 等下游靶点磷酸化增加所表明的那样， 2小时内达到最高水平，6小时后被强烈抑制（图3A）。这种严格调节的 mTORC1 激活在 Il10–/– BMDM 中受到损害，在 LPS 刺激期间观察到更高且更长的激活（图 3A）。向这些细胞中添加外源IL-10再次能够恢复在WT细胞中观察到的调节（图3A）。此外，在缺乏 STAT3（IL-10R 信号下游的关键转录因子）的 BMDM 中也观察到 mTORC1 激活时间延长，并且通过添加外源性 IL-10 无法挽救这种情况（图 3B）。这些数据表明 IL-10 通过 STAT3 信号传导抑制 mTORC1 激活。此外，IL-10 抑制 Akt 靶点富含脯氨酸的 Akt 底物 40 kDa (PRAS40) 和 mTOR 的磷酸化，并且与之前的报告一致，IL-10 增加腺苷 5'-单磷酸激活激酶的磷酸化 （AMPK）。

接下来，作者测试了 IL-10 对 mTOR 的抑制是否负责在 LPS 刺激期间维持线粒体完整性和功能，否则可能会导致功能障碍线粒体的积累，如 Il10–/– BMDM 中所见。作者用雷帕霉素处理 Il10–/– BMDM，以在 LPS 刺激期间直接抑制 mTOR，并评估其线粒体含量和耗氧量。雷帕霉素治疗的效果与外源性 IL-10 相似，可抑制功能障碍线粒体的积累，导致 Δψm 损失（图 3C），并增强 Il10-/- 细胞中的基础呼吸和 MRC（图 3、D 和 E）。此外，雷帕霉素治疗还降低了 LPS 刺激期间 Il10–/– 细胞中的 ECAR，这表明 IL-10 通过抑制 mTOR 抑制糖酵解，尽管 IL-10 也可能通过未知过程调节 GLUT1 易位。

图3

接下来作者试图确定 IL-10 如何抑制 mTOR 信号传导。因为抑制是 STAT3 依赖性的（图 3B），所以该机制应该需要转录。因此，作者进行了RNA-seq分析，并检查IL-10是否在转录上调节代谢途径，从而导致mTOR信号传导的抑制。值得注意的是，我们发现 IL-10 调节已知参与 mTORC1 上游信号传导的基因子集。这些基因的调节可能对抑制 mTOR 信号传导产生集体影响。然而，LPS 刺激前后 BMDM 中其基因产物的丰富且稳定的蛋白质水平使作者假设 IL-10 对 mTOR 信号传导的抑制可能是通过负性抑制的主动抑制来介导的。监管机构。因此，作者关注已知的 mTOR 信号传导负调节因子并检查它们的基因表达。在这些基因中，作者发现 Ddit4 在 LPS 刺激期间被 IL-10 强烈诱导（图 3，F 和 G）。这种上调也在蛋白质水平上得到证实（图3H），它需要转录因子STAT3（图3G），但不需要缺氧诱导因子HIF-1α（数据未显示），这是Ddit4的已知应对缺氧调节因子。

为了评估 DDIT4 在巨噬细胞中的作用，作者从 Ddit4–/– 小鼠中产生 BMDM，并用 LPS 刺激它们。缺乏 DDIT4 的细胞在 LPS 刺激过程中 mTORC1 激活时间延长，这种表型与作者在 Il10–/– BMDM 中观察到的表型类似。然而，与WT细胞不同，外源IL-10处理未能抑制Ddit4–/–细胞中mTORC1的激活（图3I），这表明IL-10对mTOR信号传导的抑制是DDIT4依赖性的。此外，与缺乏 IL-10 信号传导的细胞（即用 IL-10Rα 阻断抗体处理）类似，Ddit4–/– BMDM 在 ECAR 和 OCR 方面表现出显着改变（图 3J），并积累了功能失调的线粒体，导致线粒体功能丧失。Δψm 以及 LPS 刺激后 ROS 产生增强（图 3，K 和 L）。外源性 IL-10 治疗对逆转表型的影响很小，这表明 DDIT4 是 IL-10 信号转导的关键靶标。总之，这些观察结果表明，IL-10 通过 DDIT4 对 mTOR 信号传导的抑制在 LPS 刺激后巨噬细胞的线粒体清除中起着重要作用。与这个想法一致，在 Il10–/– BMDM 中过度表达 DDIT4 能够恢复 mTOR 信号传导的抑制和受损线粒体的积累。

接下来作者评估了 IL-10 在炎症反应中代谢控制的作用。线粒体已成为信号细胞器，有助于某些先天免疫途径，包括炎性体激活和 RIG-I 样受体 (RLR) 信号传导。作者利用双信号模型进行 NLRP3 炎症小体激活，其中 BMDM 用 LPS 引发（信号 1），然后用 ATP 刺激（信号 2）。作者发现 Il10–/– 和 Ddit4–/– BMDM 均表现出增强的 caspase-1 裂解，并且用 IL-10 处理 Il10–/– 细胞（而非 Ddit4–/– 细胞）导致 caspase-1 裂解最小化（ 图 4A)，表明 IL-10 通过诱导 DDIT4 抑制 caspase-1 依赖性炎症小体激活。即使在没有信号 2（即 ATP）的情况下，在缺乏 IL-10 或 STAT3 的细胞中用 LPS 刺激也足以触发 IL-1β 分泌，否则在 WT 细胞中分泌量极小（图 4，B 和 D）。IL-1β的分泌是caspase-1依赖性的（图4B），表明Il10–/– BMDMs中IL-1β的分泌是由于炎症小体的激活。此外，IL-10 抑制炎症小体激活，与 Nlrp3 转录的任何影响无关，因为 NLRP3 的过表达并不能克服抑制作用。然后作者假设 Il10–/– 细胞中线粒体 ROS 产生的增强可能作为炎症小体激活的内源信号。为了支持这一点，用抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 或线粒体 ROS 抑制剂 Mito-TEMPO 处理 Il10–/– 细胞能够抑制 IL-1β 分泌（图 4C）。在过度表达 pro-IL-1β 的 Il10–/– 细胞中，也证实了 ROS 抑制剂对炎症小体激活的影响，而不是对 pro–IL-1β 表达的影响，其中 IL-1β 分泌受到抗氧化剂的抑制。与此一致的是，Mito-TEMPO 在 LPS 刺激期间对 Il10-/- 细胞中 pro-IL-1β 的基因表达没有影响。

接下来作者测试了雷帕霉素、自噬抑制剂 3-MA 或自噬激活剂 AICAR 或 DDIT4 过度表达的治疗是否对 Il10–/– 细胞中异常的 IL-1β 分泌有影响。在缺乏 IL-10 或 STAT3 的细胞（图 4D）或过表达 pro-IL-1β 的 Il10–/– 细胞（图 4D）中，IL-1β 分泌被雷帕霉素和 AICAR 抑制，但被 3-MA 增强。已知自噬可抑制炎症小体激活。总的来说，这些数据表明 IL-10 通过抑制 mTOR 诱导线粒体自噬有助于抑制炎症小体激活。与此一致的是，在 Atg5 缺陷的 BMDM 中，IL-10 抑制 IL-1β 分泌的作用显着降低（图 4E）。由于自噬缺陷可导致 ROS 依赖性 RLR 信号传导放大，因此作者还测试了 IL-10 是否抑制 RLR 信号传导。事实上，用与 lipofectamine 复合的聚 (I:C) 刺激的 Il10–/– BMDM 表现出增强的 I 型干扰素反应，而用 NAC 或外源性 IL-10 治疗可抑制增强的反应。

图4

作者之前已经表明，肠道细菌通过肠道巨噬细胞中的 MyD88 进行感知，会导致 IL-10 缺陷小鼠患结肠炎。为了在体内测试我们当前的模型，作者从患有严重结肠炎的 Il10–/– 小鼠中分离了结肠固有层细胞，并评估了固有层巨噬细胞 (LPM) 中的线粒体含量和 mTOR 信号传导。与 LPS 刺激的 Il10–/– BMDM 类似，来自 Il10–/– 小鼠的 LPM 具有更高的线粒体 ROS，积累线粒体并损失 Δψm（图 4F），并且 mTORC1 的激活增加（图 4G）；这些发现表明，在缺乏 IL-10 的情况下，LPM 中 mTOR 信号传导增加导致线粒体 ROS 产生，通过炎症小体激活导致结肠炎的发生。与这一观点一致，与仅缺乏 IL-10 的小鼠相比，同时缺乏 IL-10 和 caspase-1 的小鼠结肠炎的病理学显着减轻（图 4H）。最后，作者发现来自IL-10R基因无效突变的IBD患者的单核细胞衍生的巨噬细胞也表现出IL-1β的异常分泌（图4I）、DDIT4表达减少和mTORC1激活时间延长（图4J）。此外，抗氧化剂或雷帕霉素分别抑制ROS或mTOR信号传导，抑制这些细胞中IL-1β的分泌（图4K）。总的来说，这些数据表明 IL-10 至少部分通过消除功能失调的线粒体抑制巨噬细胞中的 mTOR 信号传导和炎症小体激活来预防结肠炎的发生。