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干货分享 | Q-PCR干粉引物,如何溶解?保存温度和时间是多少?

现代科研基本离不开分子实验,分子实验又基本离不开PCR,PCR肯定离不开引物了,今天给小伙伴们讨论收到引物的处理问题。


QPCR 干粉引物溶解稀释的一般方法如下:


  • 收到引物后,在开启离心管盖前在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟,以防开盖时引物干粉散失。因为引物在干燥过程中,寡核苷酸在EP管底部形成白色片状沉淀。鉴于运输过程中沉淀会飘起,在打开管盖之前进行简短离心这一步骤至关重要。


  • 引物保存在高浓度的状况下比较稳定。如果对实验的重复性要求较高,合成的 OD 数较大,建议分装,避免反复冻融。


  • 引物一般配制成10-100umol/l。


  • 引物的浓度可以通过以下公式计算:引物终浓度(μM)=所需引物量(μg)/引物分子量(g/mol)/反应体积(L)。可以根据引物的OD值和分子量来计算需要加入多少液体才达到100μM的浓度,但没必要学这个,一般公司都会直接给算好,在标签处标明需要加入多少液体溶解以达到100μM的浓度。

用哪种溶剂溶解引物?


如果需要稀释引物,可以使用灭菌的去离子水或TE缓冲液(pH7.4-8.0)作为溶剂。其中,TE缓冲液比较稳定,能提供稳定的pH环境,适合于保存引物(以及质粒或基因组DNA),但也有人认为,TE中的EDTA分子会影响后续PCR的效率。

引物的保存温度和时间有什么限制?


未溶解的引物在-20℃下可保存至少1年,溶解后的引物在-20℃下避免反复冻融,可以保存至少半年以上。如果对实验的重复性要求较高,合成的OD值较大,建议将溶解好的引物事先稀释为100μmol/L的储存液,分装数份保存于-20℃冰箱。使用前,将浓溶液稀释成工作液(10pmol/μl或20pmol/μl)后进行实验。

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