常规Th17是指T辅助细胞在各种生理与病理条件下分化为Th17的能力。静息状态下,Th0分化为Th17的能力非常弱,所以外周血中极少含有Th17细胞,但是当Th0细胞受到外界因素(如刺激素,病原体等)刺激时,其中Th0可以向Th17分化,具体分化趋向取决于细胞因子的种类。其实我们检测到的Th17实际上是检测Th细胞对刺激的反应能力。

一、刺激剂
    实验中通常选用的刺激剂为PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素)。
    PMA为PKC(蛋白激酶C)的激活物,PKC则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化,形成级联反应,导致许多蛋白的表达,进而引起T细胞的活化。Ionomycin是Ca²⁺的转运剂,可将细胞器内的Ca²⁺转运至胞浆内在细胞内。

PKC可被DAG(二脂酰甘油)和Ca²⁺的共同作用而激活,因此在Ionomycin的参与下,T细胞内PKC可被进一步激活。可见,PMA与Ionomycin协同活化T细胞。二、高尔基体内陷流式细胞术仅能检测细胞内的抗原,但是活化的T细胞会将多种细胞因子分泌至细胞外,因此我们还需要阻断细胞因子分泌至细胞外。

高尔基体(Golgi)是细胞分泌的核心细胞器,各种细胞因子或蛋白合成后必须经过高尔基体的加工、转运以及生物膜系统的不停融合交换才能分泌到细胞外,因此只要将高尔基体破坏即可组织细胞因子或蛋白分泌到细胞外。我们常选用的高尔基体阻断剂为BFA或Monensin, 其中Monensin的阻断效果略差于BFA, 但由于前者价格较昂贵,现实验中多用Monensin来替代BFA。

三、CD4内吞

CD3+CD4+是Th细胞的表面标志物,但是当用PMA刺激4-6小时时,CD4+的细胞明显减少,甚至消失,这是因为PMA会诱发细胞表面CD4分子被内吞。此时我们选用用CD3和CD8反设CD4细胞,即CD3+CD8-的细胞被认为是CD3+CD4+的细胞。值得注意的是,CD4内吞现象出现在人源细胞中,对于小鼠细胞,再进行PMA刺激时,对CD4几乎没有影响,因此检测小鼠Th17时可直接用CD4设门。
 四、试剂配置方案(举例)

五、实验步骤

1、 单细胞悬液制备:将脾脏组织置于铁质滤网,均匀研磨至脾脏细胞充分脱落,用PBS将滤网上粘连的脾脏细胞进行冲洗,收集洗脱下来的脾脏细胞。将小鼠腿骨进行清理,清除肌肉组织,仅留腿骨。用剪刀将小鼠腿骨两端进行剪切,用注射器吸取PBS对小鼠腿骨进行冲洗,直至将骨内髓质完全洗脱为止。将洗脱的髓质均匀研磨,用滤网进行过滤,收集洗脱下来的骨髓细胞。

2、 将制备的单细胞悬液500 g离心5 min,去上清,取沉淀。

3、 将细胞沉淀用2 mL 溶血素进行重悬,室温反应10 min将红细胞进行裂解。

4、 500 g离心5 min,去上清,取沉淀。

5、 加入2 mL PBS 将细胞沉淀进行洗涤,重悬后 500 g离心5 min,去上清,取沉淀。

6、 用1 mL RPMI培养基,吹打混匀重悬细胞。

7、 细胞按1:10或1:20倍稀释,进行细胞计数。

8、 取5*10⁶个淋巴细胞进行刺激,加入PMA、Ionomycin和Golgistop,37℃培养4 h。

9、 刺激完成后,500 g离心5 min,弃上清。

10、 加入5 mL PBS重悬细胞,500 g离心5 min,弃上清。

11、 加入100 μL PBS重悬细胞,加入APC-CD4抗体1 μL,涡旋混匀,室温避光反应20 min。

12、 每管加2 mL细胞固定液,室温避光孵育20 min,600 g离心5 min,弃上清。

13、 每管加入2 mL细胞破膜液,室温避光孵育10 min,600 g离心5 min,弃上清。

14、 每管加入2 mL细胞破膜液,600 g离心5 min,弃上清。

15、 加入FITC-IL17A 抗体1 uL,涡旋混匀,室温避光孵育30 min。

16、 每管加入2 mL细胞破膜液,600 g离心5 min,弃上清。

17、 每管加入300 uL PBS,涡旋混匀,上机检测。

五、实验结果展示