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实验干货丨微生物学检测——菌落总数常见操作方法 菌落计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN法），其中平皿法可分为倾注平皿法和涂布平皿法，常见的菌落总数操作方法见表1。 测试标准 适用范围 操作方法 GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》 食品 倾注平皿法/菌落总数测试片 FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 食品 倾注平皿法/螺旋板法 GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》 饲料 倾注平皿法 GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》 游泳池水 倾注平皿法 GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法 微生物指标》 饮用水/水源水 倾注平皿法/酶底物法 WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》 环境 六级筛孔撞击式微生物采样器 GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准 附录B2》 一次性卫生用品 倾注平皿法 《化妆品安全技术规范》2015版 化妆品 倾注平皿法 BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 化妆品 平皿法/膜过滤法 USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 药品 平皿法/薄膜过滤法/MPN法 BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查：微生物限度计数》 表1 常见菌落总数的操作方法汇总 根据上表的适用范围和操作方法可得出，平皿法是使用范围最广。 根据测试标准适用范围和样品特性： A.平皿法因可操作性性强，会更多用于污染度高的被检样品； B.薄膜过滤法适用于测试量需求大且污染度一般的液体样品； C.MPN法可用于微生物计数时精确度较差时，包括对于某些微生物污染度很小的样品。 故在日常测试中，可根据样品的污染度情况去选择更合适的菌落总数测试操作方法。 样品的取样量与稀释液选择 样品的取样量与其质量标准或测试方法去选择，对于官方标准未明确取样量的，亦可根据结果的代表性加大取样量。稀释缓冲液的选择则是要求样品在稀释缓冲液中能够充分混合，从而保证样品的均一性，故不同样品，会有不同的稀释液需求。日常工作中，常见的稀释缓冲液与要求见表2。 测试标准 样品量 稀释液 备注 GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》 25g/mL 无菌生理盐水/磷酸盐缓冲液 FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 50g/mL 磷酸盐缓冲液/无菌水 GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》 25g/10g 0.85%生理盐水/磷酸盐缓冲液 GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》 原液 无菌生理盐水 GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法 微生物指标》 原液 无菌生理盐水 WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》 28.3L/min，（5-15）min 不适用 GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准 附录B2》 10±1g 无菌生理盐水（200mL） 不进行梯度稀释，做5平行 《化妆品安全技术规范》2015版 10g/mL 无菌生理盐水 无法充分溶解稀释液中的样品可加吐温80和/或石蜡 BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 1:10（样品：加稀释液后） 无菌生理盐水、磷酸盐缓冲液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液等 最终的取样量与稀释液，需通过样品方法学适用性验证方能使用。 USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查：微生物限度计数》 表2 常见的稀释缓冲液信息汇总 常见培养条件 菌落总数的培养条件会因不同的样品类型或制定机构而有所差异，其差异包括培养基、培养温度和培养时间的选择。菌落总数常见的培养条件见表3。 测试标准 培养基 培养温度 培养时间 GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》 平板计数琼脂（PCA） 36±1℃（水产品30±1℃） 48±2h（水产品72±3h） FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 35±1℃（牛奶32±1℃） 48±2h GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》 营养琼脂（NA） 30±1℃ 72±3h GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》 36±1℃ 48h GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法 微生物指标》 36±1℃ 48±2h WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》 35~37℃ 48h GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准 附录B2》 35±2℃ 48h后 《化妆品安全技术规范》2015版 卵磷脂、吐温80-营养琼脂 （LTNA） 36±1℃ 48±2h BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA） 32.5±2.5oC 72±6h USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 3~5天 BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查：微生物限度计数》 结果观察与报告 菌落总数在进行计数时，肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU/cfu，Colony Forming Units）进行报告。在计数时，首先需明确计数范围是否符合要求，从而保证测试结果的准确性和可靠性，不同的测试方法在首选计数范围会有一定差异，以及显色剂在观察中的应用也有一定的要求。详情见表4。 测试标准 培养基中是否可加显色剂 首选计数范围 最终结果报告 GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》 是 30~300cfu 100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字，＞300cfu的则报告TNTC2，采用“四舍五入”。 FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 否 25~250cfu ＜25cfu则报告＜25或实际值，＞250cfu则报告＞250或TNTC2。 GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》 否 30~300cfu 100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字，＞300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。 GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》 否 30~300cfu 100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字，＞300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。 GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法 微生物指标》 否 30~300cfu 100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字，＞300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。 WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》 否 无 报告cfu/m3 GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准 附录B2》 否 无 全部无生长报＜4cfu/g（mL），若生长，报100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字。 《化妆品安全技术规范》2015版 是 30~300cfu 100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字，＞300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。 BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 否 平皿法：30~300cfu；薄膜过滤法：15~150cfu。 100cfu以内报整数，超过100cfu两位有效数字。 USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 否 平皿法：不超过250cfu；薄膜过滤法：记录结果。 取两位有效数字报告 BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查：微生物限度计数》 否 平皿法：不超过300cfu；薄膜过滤法：不超过100cfu 取两位有效数字报告 注： 1. 显色剂一般为TTC，TTC全称为0.5%氯化三苯四氮唑。加此显示剂后，多数菌落显示红色。 2. TNTC全称为多不可数，即Too Number To Count。 表4 结果观察与报告的一般要求 菌落总数的测定，不同样品有不同的特性，故在进行此方面卫生学测试时，结合行业需求，以及样品的生产工艺、消费对象、使用方式等需求，选择合适的测试操作流程，同时保证在报告结果时，亦需根据市场所选用的方法进行报告结果。 综合以上，卫生学的菌落测试在实验操作中虽然有差异，但总体的差异性不大，比如培养基都是非选择性生长培养基，培养温度基本在35℃左右，培养时间则温度越高，时间则可减少。故保证菌落总数测试结果的准确性与可靠性时，根据实际需求，通过调节测试方法的取样、稀释液、培养条件等来建立更符合本实验室的菌落总数测试方法。 |
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