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动物建模| 盘点肺动脉高压的几种建模方法

肺动脉高压 ( PAH) 指肺动脉压力异常升高的一种血流动力学和病理生理状态,是一种致命性心肺疾病,最新流行病学数据显示特发性和遗传性 PAH 发病率为每百万居民 5 例,患病率为每百万居民 25 例,并且逐年增加趋势明显。

PAH 发病机制非常复杂,涉及炎症、氧化应激和代谢转换等机制,尽管对 PAH 及其发生机制研究取得了很大进展,但目前最先进的治疗方法仍然不能靶向正在进行的重构过程,而是通过调控涉及维持血管张力的信号通路来治疗PAH,5 年生存率只有 57%。

按临床、治疗和病理生理学特点,肺动脉高压分为5类:动脉型PAH、左心疾病导致的PAH、肺病或缺氧导致的PAH、肺动脉阻塞导致的PAH、未知因素导致的PAH。尽管不同亚类PAH的病因不同,但都表现出相似的病理变化,包括肺血管内侧肥大、内膜增生和纤维化、外膜增厚伴随中度血管周围炎症细胞浸润、丛状扩张性病变以及原位血栓形成,肺血管不断增生、重构使血管部分闭塞,肺血管阻力增加,导致进行性右心衰竭和功能衰退,甚至死亡 。

精确阐明 PAH 发病机制,寻找新的有效治疗策略一直是临床的迫切需求和研究 热点,而动物模型是实现这一目标的基础。然而,目前还没有一种 PAH 动物模型能够复制 PAH 的所有特征,包括血液动力学改变和组织学重构。今天我们就来盘点一下常用的PAH动物造模方法及优劣势,帮助你根据研究方向来选择合适的造模方法。

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造模方法











野百合碱诱导模型

野百合碱(MCT)是从野百合种子中提取的一种吡咯烷生物碱,它能够引起肝毒性和肺动脉高压。MCT 必须在体内经肝脏细胞色素 P450 3A4 代谢成毒性代谢物野百合吡咯( MCTP) ,野百合吡咯可以在肺血管内皮细胞中形成DNA 和蛋白加合物,从而导致细胞周期停滞,使内皮细胞凋亡,血管内膜剥脱,从而引起肺动脉平滑肌细胞进行性增殖和肺血管重塑 。

MCT模型的特征在于内皮细胞凋亡和血管周围炎症,这与人肺动脉高压发病的生理病理机制类似。MCT模型能够更好地帮助我们了解肺血管重塑的过程以及炎症反应在其发病机制的重要作用。

具体方法:

首选大鼠,经颈背部或腹部单次皮下注射 1%MCT溶液, 广泛采用的剂量主要有50 mg·kg -1 和60mg·kg-1,一般2-3周后造模成功。MCT 诱导的肺动脉高压程度取决于 MCT 的剂量 。

实验原理:

MCTP 在血浆等水溶液中快速降解(半衰期为3-4 s) ,但它可以在红细胞中积累和转运,保留了与肺组织相互作用的能力,这种作用导致内皮细胞损伤,并于数周后进展为 PAH。肺内皮细胞被认为是 MCTP 的特异性靶点,MCTP 能与内皮细胞膜发生特异性交联,直接导致内皮细胞功能受损。因此,内皮细胞是最早发生病变的细胞。

在 MCT 给药后 9 -24 h 内皮细胞发生改变,病变以内皮细胞肿胀、胞质囊化、胞浆不规则增厚、溶解为特征,并随时间推进而进展,最终扩展到肺血管的各级血管,其中毛细血管和小动脉 更为严重。毛细血管膜的通透性增加,此时出现血小板和纤维蛋白血栓栓塞,大量的小血管管腔被部分或完全阻塞。中膜改变发生在内膜改变之后,其特征是平滑肌肥大、增生,平滑肌延伸至正常非肌化的末梢小动脉。细胞外基质( 胶原蛋白、弹力蛋白) 含量增加,并与增殖的平滑肌细胞共定位。外膜水肿和炎症细胞浸润,晚期见成纤维细胞增殖、胶原沉积、出血等。

在血管重构过程中伴随平滑肌细胞迁移、新内膜形成、平滑肌细胞肥大和结缔组织过度形成。小动脉重构发生在中、大动脉之前,且小动脉中膜增厚程度要大于大动脉。此过程伴随着肺血管阻力和肺动脉压力持续增加,其严重程度随时间推移和MCT 剂量增加而进展。炎症、氧化应激、代谢重编程等参与了 MCT PAH 模型机制调控,涉及 p38 MAPKα、NF- κB、PI3K/Akt /mTOR、NO 等信号路径。

造模评价

通过血流动力学指标判断模型是否成功,主要指标有肺动脉平均压力、右心室收缩压、右心室肥厚指数。MCT 模型具有技术简单、可重复、时间短、稳定性好、低成本等优点。MCT 能引起内皮功能障碍,较好模拟临床上炎性相关的 PAH,但对重度血管增生性 PAH 的 模拟有限。另 外,MCT 诱导的大鼠通常死于 MCT 诱导的肺毒性、静脉阻塞性肝病和心肌炎,而不是死于肺动脉高压 。由于 MCT 模型形态学变化发展得非常快并且不易通过治疗干预来预防, 所以作为临床 PAH 模型还具有一定的局限性。

MCT 诱导的 PAH 大鼠模型能够模拟人类 PAH 的几个关键方面,包括血管重构、内皮功能障碍、平滑肌细胞增殖、炎性细胞浸润和右心室衰竭。该模型只需要单次药物注射,且成本低廉,易于重复。其不足之处是不能模拟严重 PAH 病理学的关键特征———新内膜和丛状病变,以及随时间推移而 PAH 可逆( 4 周后) ,易用药物预防或治愈。

低氧诱导型

低氧性肺动脉高压是临床常见的一类PAH,常由慢性呼吸系统疾病,如慢性阻塞性肺疾病、睡眠呼吸暂停、高原病等导致。慢性缺氧会引起内皮细胞损伤,以致相关舒缩因子失衡,增加肺血管收缩反应并促进血管重塑,最终发展为肺动脉高压。近年来缺氧性肺血管收缩和肺动脉重塑的研究主要侧重于内皮素-1、一氧化氮、环氧合酶和腺嘌呤核苷酸途径。

方案一:将动物置于低氧舱内,通入N2和O2混合气体,通过控制器将O2 浓度控制在(10.0 ± 0.5)%(体积分数),缺氧时长2-8周,喂养期间定期清扫并补充食物和水。大量研究证明,持续缺氧或间断性缺氧(约8h·d-1)均可发展为PHA,并且低压低氧舱或常压低氧舱也均可成功制备模型。

方案二:将动物置于常压低氧高二氧化碳氧仓中,仓内氧浓度维持在 9%-11% ,二氧化碳浓度维持在 5% -6% ,每天8h,每周6d,饲养4周 。吸入低氧伴高二氧化碳混合气体制备PHA 动物模型更符合临床患者情况 。慢性高碳酸血症常见于缺氧性肺病患者,并且根据临床观察,除非同时存在高碳酸血症,否则低氧性肺病很难发展为肺动脉高压,可见二氧化碳分压与肺动脉压力密切相关。

造模评价

通过慢性缺氧诱导肺动脉高压,易于操作,最常用的动物是大鼠和小鼠。但慢性缺氧反应在物种间存在差异,即使是同一物种随着年龄、性别的不同,反应也会受到显著影响,最常用的动物是大鼠和小鼠。由于缺氧诱导是可逆的,因此较难模拟临床重症PHA,并且不能完全模拟 PHA 的血管损伤情况。尽管如此,这两种模型都为体内研究 PHA 发病机制提供重要的疾病模型。

肺栓塞模型

肺栓塞是由内源或外源性栓子阻塞肺动脉,引起肺循环和右心功能障碍的临床综合 征 。慢性血栓栓塞型肺动脉高压是PHA 的一种独特形式,是急性肺栓塞或肺动脉原位血栓形成的长期后果,表现为肺动脉增大、内膜受损及周围血管阻塞 。

具体方法

此模型有2种方法:注射血栓或者异物

注射血栓:血栓模型是从自体或供体(异源)动物获得血液样本在体外凝结成血栓,然后再将其注入实验动物中。注射血栓可较好表现急性肺栓塞的病理生理情况,但是由于离体血凝块的大小和体积均不规则,难以保证肺血管阻塞的程度和持续性,而且自体肺栓塞模型还需要进行2次手术,在大鼠、兔或猪中会产生循环休克,操作复杂。

注射异物:将惰性材料注入颈静脉的方法来模拟肺栓塞,包括大鼠、兔、狗、羊、猫、猪都可以建立 慢性血栓栓塞肺动脉高压模型。将体质量(35-0-500g的大鼠,通过右颈静脉注射聚苯乙烯微球(15-25 μm,130万-195万个珠/100g)。该方法可以控制进入肺部的微球数量,较准确地增加肺血管阻力,还避免发生免疫反应、大鼠纤维蛋白溶解率高等问题。但也有一定的局限性,微球是阻塞在肺部毛细血管前小动脉中,而不是临床上通常观察到的阻塞在近端肺动脉。

造模评价

栓塞性PHA 模型引起的血流动力学变化与临床一致,产生的促凝状态、血栓前变化可作为临床避免血栓栓塞及外科手术等干预机制的实验对象。

手术分流模型

肺动脉高压是先天性心脏病的常见并发症,高肺血流量引起的肺血管重构是其重要的病理过程。

建模方法

手术分流可以增加肺部血流量,其中体循环动脉⁃肺动脉之间的分流和动⁃静脉之间的分流是较常用的左向右分流型肺动脉高压建模方法。

方案一:体循环动脉⁃肺动脉之间的分流

由于大、中动脉压力高于肺动脉压力,通过压力阶差在两者间建立分流可使体循环血液分流至肺循环,使肺循环血液增多。该方法多采用犬、猪、羊等大型动物。包括诱导主动脉和肺动脉、左颈总动脉和肺动脉、左锁骨下动脉和肺动脉分流等。尽管能更好的模拟临床上慢性心脏病相关的PAH,但由于开胸手术难度较大、创伤大、饲养大体积动物困难及成本等问题,因此较难推广和应用。

方案二:动⁃静脉(A⁃V)之间的分流

利用动静脉间较大的压力差,分流后动脉血流入静脉,使流回右心的血液增加,继而使右心射入肺动脉的血液增多。该方法多采用兔、鼠等小型动物。大鼠多采用主动脉-腔静脉分流;兔多采用颈总动脉-颈静脉分流;有研究首创通过腹主动脉-下腔静脉分流建立小鼠的PAH模型 ,小鼠模型为研究PAH的分子机制提供了更多机会。A-V分流具有死亡率低、侵入性低、通畅性较高、成本低等优点。

造模评价

随着 PAH 机制研究从单纯的血管收缩转变为血管增生,血液分流的作用被认为在PAH的发展中至关重要。

遗传修饰模型

由遗传因素导致的肺动脉高压称为遗传性肺动脉高压 ,主要有家族性肺动脉高压(FPAH)和伴基因突变的特发性肺动脉高压(IPAH)。

过去的研究中科学界不断揭示PAH相关基因:BMPR2、ALK1、ENG、SMAD9、SMAD1、CAV1、KCNK3、TBX4、E2F2AK4、GDF2 、ATP13A3、AQP1、SOX17等,增强了对 PAH复杂遗传基础的理解。

基因敲除模型

据文献报道,约有70-80%的 FPAH和10%-20% 的IPAH病例是由BMPR2突变引起的。有研究证明 BMPR2突变类型与PAH敏感性之间存在基因型⁃表型关系。去除外显子 4、5的BMPR2 基因敲除小鼠会表现出轻度 PAH,损害肺血管系统对长时间低氧的重塑能力。还有去除第2个外显子的 BM-PM2 基因敲除小鼠,这种小鼠对低氧反应性增加。除此之外,有研究采用平滑肌特异性强力霉素诱导 BMPR2 第899位氨基酸的突变,产生了非常接近人类的PAH。

除了BMPR2 基因敲除模型,还有其他基因敲除模型,如敲除血管活性肠肽的小鼠(VIP-/-) 自发形成中度至重度PAH;敲除载脂蛋白E的小鼠(APOE -/-)可自发为PAH并伴有肺动脉肌肉化;内皮素受体B(ETB)敲除模型,当内皮素受体表达降低会增加肺内皮素水平,从而促进PAH。

基因过表达模型

5-羟色胺转运蛋白的过度表达是PAH形成过程中的关键因素。首个5⁃HTT过表达转基因小鼠模型是通过一个人工染色体对5⁃HTT的C端血凝素抗原决定簇和内部核糖体进入位点的一个 lacZ报告基因进行修饰。之后有研究采用平滑肌启动子SM22建立5⁃HTT基因过表达模型(SM22-5⁃HTT+),这种小鼠肺部钾离子通道表达水平降低,并且5⁃HTT 表达增加的水平非常接近于人PAH 。

常用的还有过表达白细胞介素6(IL-6)的转基因小鼠,对研究 IL-6在PH 发展中的作用以及抗炎方面发挥重要作用。有研究采用过表达血管生成素1(Ang-1)建立大鼠转基因模型,Ang-1 的表达水平与PAH的严重程度成正比。研究表明大约5% 的S100A4/Mts-1过表达的小鼠发生肺血管重塑,可观察到其他模型没有的丛状病变。

造模评价

利用基因工程技术制备PAH模型,能从动物整体水平研究目的基因的表达调控规律,加深了我们对PAH病理生物学及治疗学的认识,但是该方法存在技术难度大、动物模型品系过少(主要是小鼠)等缺点,仍需进行多方位的改进。


小结

PAH动物模型的发展主要经历了2个阶段,第1阶段是肺动脉非特异性内膜和外膜增厚,主要包括经典模型(即低氧和MCT);第2阶段是发生丛状病变,血管逐渐闭塞,肺动脉压进行性升高,即手术分流、栓塞模型、遗传修饰造模。

我们通过研究中的不同动物模型,同时重点关注它们与 PAH患者的相关性, 来帮助科研工作者根据疾病的不同阶段选择合适的动物模型,取得理想的造模效果。同时,也为进一步阐明PAH的病理机制、提高PAH患者的预后、探索新的治疗靶点提供基础。


来源:孙姝婵,方莲花,杜冠华.肺动脉高压动物模型研究进展[J].中国药理学通报,2020,36(08):1037-1040.


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