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分子生物学:PCR检测技术操作步骤

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是利用一段DNA为模板,在DNA聚合酶和核苷酸底物共同参与下,将该段DNA扩增至足够数量,以便进行结构和功能分析。PCR检测方法在临床上快速诊断细菌性传染病等方面具有极为重要的意义。

PCR为最常用的分子生物学技术之一。至今在世界范围内都有广泛的应用,作为生物学实验的一个重要的方法,其有着不可估量的作用。

PCR(3).jpg



简单来说分为以下三个步骤:

  1. DNA变性,加热使靶DNA序列双链解离成单链DNA。

  2. 引物与靶DNA退火,适当降低温度,使两个引物分别结合成靶DNA两条的3′末端向5′末端延伸。

  3. 引物延伸,在DNA聚合酶的催化下,引物沿着靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA链在变性解离后,又可作为模板与引物杂交,并且在DNA聚合酶的催化下,引导合成新的靶DNA链。如此反复进行以上3个步骤,即可使靶DNA片段指数性扩增。


具体操作步骤如下:

1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。       

  • 10×PCR buffer                     

  • 5 μl     dNTP mix (2mM)               

  • 4 μl     引物1(10pM)                   

  • 2 μl     引物2(10pM)                   

  • 2 μl     Taq酶 (2U/μl)                 

  • 1 μl     DNA模板(50ng-1μg/μl)    

  • 1 μl     加ddH2O至 50 μl    

  • 视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,最后在72℃ 保温7min。 

3.结束反应。PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μl氯仿进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。 

虽然,PCR技术已经相当成熟,但对于一个传统实验室,不但要满足高科技的实验设备,合理的空间布局等基本条件,一般还具有人员素质专业性高、管理严谨度高、投入成本高、结果责任性高等特点。

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