石蜡切片荧光TUNEL实验步骤

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-二甲苯Ⅲ10min无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-50%酒精5min蒸馏水洗。

2、破膜：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37度温箱孵育15-30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、配制TUNEL：按片子数量和组织大小取Tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按1:9混合，避光待用。

4、孵育：将配制好的TUNEL加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

6、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

7、镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光。）

石蜡切片荧光TUNEL结果判读

  DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，Roche试剂盒为FITC荧光素标记，阳性凋亡细胞核为绿色。