细胞集落形成实验是检测培养细胞增殖能力的有效方法之一,通过计算集落形成率(colony forming efficiency),来测定测试细胞的增殖能力。

实验前准备:6孔板、吸管、枪头、血球计数板、基质胶等放入超净工作台消毒30min。

1、平板集落形成实验(适用于贴壁细胞)

①取出贴壁率>90%的细胞(处于对数生长期),消化离心,重悬细胞并进行细胞计数。

②6孔板种板:实验分组,每个孔中加入1000个细胞,放入CO2培养箱培养。

③培养1周后,当肉眼可见集落形成时,取出6孔板,弃除培养液,每孔加入2mL甲醇固定30min,弃除甲醇,每孔加入2mL0.1%结晶紫染色3min,然后清洗掉结晶紫,数码相机拍照,光镜下计数集落

结果展示:

2、软琼脂集落形成实验(适用于悬浮细胞)

1.收集对数生长期的细胞进行活细胞计数,然后调整细胞浓度,用含20%FBS的DMEM制成1000活细胞/ml的细胞悬液。 

2.用蒸馏水制备1.2%、0.7%两个浓度的低熔点琼脂糖,高压灭菌后,维持在40℃不会凝固; 

3.1.2%琼脂糖和2xDMEM等体积混合,6孔板中加入1.4ml,RT凝固作为底层琼脂,置CO2温箱中备用; 

4.0.7%琼脂糖和2xDMEM等体积混合,再加入细胞悬液充分混匀,RT凝固作为上层琼脂,勿有气泡,将实验组和对照组分两组加好,盖上盖并作好标记。在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。  

5.然后移培养板或平皿于CO2培养箱中37℃进行培养。 

6.培养7～l0天,肉眼观察并计数细胞集落。 

结果判定:

以肉眼可见的细胞团作为计数集落的标准。集落的计数和计算:集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔,      

 集落形成率=集落数/接种培养细胞总数×100% 

结果展示: