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小鼠糖化血红蛋白(GHbAlc)酶联免疫试剂盒1.实验原理: 本试剂盒采用竞争法检测样本中糖化血红蛋白(GHbAlc) 的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本,再加入生物素标记的识别抗原,在37℃下孵育30min,两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物,经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原,然后加入亲和素-HRP,在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合,洗涤后结合的HRP催化TMB(四甲基联苯胺)成蓝色,随后在酸的作用下转化成黄色,在450nm波长下有吸收峰,吸光值与样本中抗原的浓度成负相关。 2.试剂盒组成:
备注: a.试剂盒中“标准品/样品稀释液”为超纯水(可用双蒸水替代),“终止液”为2M的H2SO4,洗涤液为含0.15%吐温-20的PBST,如不够可自行配制。 b.不同公司的缓冲体系存在较大差异,请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果。 c.浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出,稍微加温后即会消失,不影响使用。 d.浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP稀释前务必先离心同时应避免反复冻融。 3.试剂盒保存 本试剂盒可以在2-8℃下保存6个月,在-20℃下可以保存更长的时间。酶标板为真空包装,板条可以拆卸,拆开以后如一次不能用完,请放入提供的密封袋中,放入干燥剂,2-8℃保存,在一个月之内仍然有效。试剂不能反复冻融。 4.需要而未提供的试剂和器材 1.37℃恒温箱。 2.标准规格酶标仪。 3.精密移液器及一次性吸头 4.双蒸水或超纯水 5.干净的试管或Eppendof管 6.吸水纸 7.自动洗板机或8道排枪 8.ELISA数据处理软件,推荐使用ELISACalc 9.500ml烧杯的和适当量程的量筒 5.试剂准备 a. 使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。 b. 本试剂盒可以直接加样,如浓度过高,可以进行适当比例的稀释(推荐2-5倍稀释),计算时应将结果乘以稀释的倍数。 c. 洗涤液为25倍浓缩液,使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中,用双蒸水定容到500ml即为工作液。 d. 标准品的稀释:先用标准品/样品稀释液将标准品冻干粉定容到150μl,然后漩涡混匀30秒即为标准品原液(24小时内用完)。取5支干净的Eppendorf管,每管加150μl的标准品稀释液,分别标记上48mmol/L,24mmol/L,12mmol/L,6mmol/L,3mmol/L .取150μl标准品原液加入标记48mmol/L 的管中,混匀后同样取出150μl,加入下一管,以此类推直至最后一管。零孔:直接加标准品/样品稀释液。(见下图) e.生物素抗原的稀释:抽取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中,漩涡混匀15秒至冻干粉完全溶解,然后将所有液体移入稀释液瓶中,再次漩涡混匀30秒即为生物素抗原工作液。 f.亲和素-HRP的稀释:低速离心(使浓缩液全部沉到管底),将浓缩亲和素-HRP全部移入相应稀释液中然后漩涡混匀30秒即为亲和素-HRP工作液。 6.样本前处理 a. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。 b. 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。 c. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。 d. 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 e.细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。 f.组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。 7.洗板方法 a. 手工洗板:先洗去酶标孔中的的液体,在吸水纸上拍干,然后每孔加入300μl稀释好的洗涤液,轻轻摇晃30秒,然后甩掉,在吸水纸上拍干,重复4-5次。 b. 洗板机洗板:洗板机洗板比较便捷,但应操作熟练后使用。 8.详细操作程序 a. 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。 b. 空白孔不加样,只加显色剂A,B和终止液用于调零。 c. 标准品孔:每孔加入稀释好的标准品50μl,零孔加入标准品/样品稀释液50μl,然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必须要做,并将其作为标曲的最后一个点)。 d. 样品孔:加入样品50μl(推荐直接加样,浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍),然后加入生物素抗原工作液50μl。 e. 轻轻摇晃,盖上封板膜,37℃培养箱中孵育30min。 f. 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。 g. 第一次洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。 h. 加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中,轻轻摇晃,盖上封板膜,37℃培养箱中孵育30min。 i. 第二次洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。 j. 显色:每孔先加入显色剂A 50μl,再加入显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。 k. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色). l. 测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。 m.计算:根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程,建议用专用计算软件进行计算,推荐使用ELISAcalc进行计算,拟合模型选用logistic曲线(四参数)。标曲示意图如下:
9.操作总结 准备试剂,样品和标准品;加入准备好的样品和标准品,生物素抗原,37℃反应30分钟;洗板5次,加入亲和素-HRP,37℃反应30分钟;洗板5次,加入显色液A、B,37℃显色10分钟加入终止液;10分钟之内读OD值。 10.性能参数 a. 批内差:CV<10% b. 批间差:CV<12% c. 检测线:0.3-90mmol/L d.保存:2-8℃ e.规格:48T/盒 f.有效期:6个月(2-8℃)。
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产品编号 MD105237
本试剂盒采用竞争法检测样本中糖化血红蛋白(GHbAlc) 的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本,再加入生物素标记的识别抗原,在37℃下孵育30min,两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物,经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原,然后加入亲和素-HRP,在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合,洗涤后结合的HRP催化TMB(四甲基联苯胺)成蓝色,随后在酸的作用下转化成黄色,在450nm波长下有吸收峰,吸光值与样本中抗原的浓度成负相关。 a. 批内差:CV<10% b. 批间差:CV<12% c. 检测线:0.3-90mmol/L d. 保存:2-8℃ e. 规格:48T/盒 f. 有效期:6个月(2-8℃)。 |