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点亮模型第21期 | 卵巢癌动物模型

5月8日是世界卵巢癌日。2020年卵巢癌新发病例31万例,其中中国6万例,作为女性生殖系统中常见的恶性肿瘤,卵巢癌的病死率居首位,是世界上第二大妇科恶性肿瘤死亡原因,被称为“妇癌之王”。卵巢癌(ovarian carcinoma)根据癌细胞的组织类型分类,可分为三类,最常见的为上皮性肿瘤(>85%)。大部分为腺癌,主要有浆液性腺癌,子宫内膜样腺癌,粘液性腺癌,透明细胞腺癌四个种类。

 一、药物治疗


卵巢癌治疗模式逐年进步,1959年FDA首批环磷酰胺可用于卵巢癌,1998年紫杉醇+卡铂成为卵巢癌治疗的金标准,2017年脂质体多柔比星+卡铂方案被NCCN指南收录为卵巢癌一线治疗方案。


靶向及免疫药物作用显著,主流靶点分为以下三类:

成熟靶点:PARP、PD1/L1、TOP1、VEGF、HER2;热门靶点:FOLR1、MSLN、CD47、BRD、AXL;潜力靶点:CTLA-4、PI3K、ATR、GPC3、MEK、BTK等。


PARP抑制剂目前是卵巢癌治疗领域最成熟的药物靶点和卵巢癌一线化疗后单药维持治疗的首选用药。


截至目前,全球已获批上市的PARP抑制剂总共有6款(阿斯利康的奥拉帕利[全球首个PARP抑制剂,2014年上市,2018年进入中国,市场表现亮眼]、再鼎医药的尼拉帕利、恒瑞医药的氟唑帕利、百济神州的帕米帕利、辉瑞的他拉唑帕利、Clovis公司的芦卡帕利),其中前4款已在我国获批上市,国内也有超20家企业布局PARP抑制剂,有仿制也有创新。


2018年全球卵巢癌市场市值18亿美元,预计在2028年将达到67亿美元,预测期(2018-2028)内的复合年增长率(GAGR)为14.4%。PARP抑制剂在2028年预计有3款药物将在全球市场中占据40%份额。

 二、动物模型


常用的卵巢癌模型有:基因工程卵巢癌动物模型、移植性卵巢癌动物模型、自发性卵巢癌动物模型、诱导性卵巢癌动物模型。



1、基因工程卵巢癌动物模型

将DNA序列克隆至实验动物的生殖细胞系,或者删除或者敲除小鼠体内基因,定向生成特定基因的生殖细胞系。具体方法有转基因模型和基因敲除模型。


1.1转基因模型

造模方法:学者将苗勒管抑制物Ⅱ(MISRⅡ)基因启动子的载体注射到C57BL/6和C3H品系F1代0.5d胚胎中,胚胎植入假孕雌性后成功建成了MISRⅡ卵巢癌转基因小鼠。该种模型表现为浆液性卵巢上皮性癌病例特征。


1.2基因敲除模型

造模方法:卵泡刺激素(FSH)受体敲除FORKO小鼠生长到12个月以上时,92%的小鼠表现出多种卵巢病理,大多数肿瘤位于右侧卵巢,类型多为浆液性腺瘤和囊腺癌。


备注:卵泡刺激素(FSH)受体及其配体同时敲除的小鼠模型,形成了年龄相关卵巢增生、上皮性包涵囊肿、管状结构和卵巢病理类似的浆液性囊状腺癌。敲除卵泡刺激素b亚单位和FSHRKO的小鼠模型,形成了上皮性浆液性囊状腺癌,其包含囊肿、年龄相关卵巢增生、管状结构均和临床卵巢癌病理类似。


应用:基因敲除模型应用于研究卵巢癌的发生与各种因素的关系。


1.3条件性基因敲除模型

造模方法:将条件性失活PTEN基因小鼠和条件性失活结肠腺瘤样息肉病(APC)基因杂交获得的双基因条件性敲除品系(APC-/PTEN-)中,将5×107CFU的AdCre注射到56~70日龄该品系小鼠右侧卵巢囊腔中,100%发生人样卵巢子宫内膜样腺癌。条件性敲除Tp53和Rb1基因小鼠97%的个体能够发生卵巢肿瘤。条件性敲除小鼠卵巢颗粒细胞中的Brca1基因,能够导致卵巢和子宫角囊性肿瘤的发生。


优缺点:基因工程卵巢癌动物模型因其致癌过程和病理表现更接近人体,可以在自然的情况下使正常细胞演化成肿瘤细胞,并且可以完整地展现癌前病变,有助于卵巢癌的早期发现。但是其对实验室及仪器要求高,个体差异大,操作困难,周期长,实验成本高。



2、移植性卵巢癌动物模型

移植性肿瘤动物模型即把人或动物的肿瘤组织或细胞移植到同系、同种或者异种动物体内。


动物的选择:常用小鼠有BALB/c小鼠、SCID小鼠和C57BL/6J小鼠。常用大鼠有Fischer大鼠、SD大鼠等。各种来源肿瘤皆可应用于裸鼠模型,裸鼠模型的种植部位也可选择皮下、卵巢原位、腹腔移植、淋巴移植。裸鼠模型比其小鼠和大鼠模型比较,其应用更多。


2.1原位移植模型

造模方法:该方法是将体外培养的卵巢癌细胞注射到动物卵巢表面,从而产生肿瘤。


实验动物麻醉,侧卧位固定,取肋下做侧切口,切开皮肤肌层,暴露卵巢,在解剖显微镜下剪开卵巢白膜,将肿瘤细胞植入卵巢包膜,并用可吸收线缝合卵巢,逐层关腹。术后可给实验动物注射青霉素以防术后感染。将ID8细胞注射到C57BL/6雌性小鼠左侧卵巢囊中,可成功制备卵巢癌原位模型。将卵巢癌细胞注射到BALB/c裸鼠卵巢表面成功构建卵巢癌转移模型。将ID8细胞注射入卵巢囊中,亦可成功制备该类模型。


优缺点:该模型有利于研究卵巢癌的转移、扩散机制,同时原位移植影响因素较多,成功率低,因此该方法建模难度较大。


2.2皮下移植模型

该方法可分为细胞悬液移植和组织块移植两种。


1)细胞悬液移植:主要是将体外培养的卵巢癌细胞株接种于裸鼠皮下,常用部位为颈背部皮肤,抓取动物并固定,消毒局部皮肤,一般按照每只动物0.2mL悬液进行注射。在注射前要注意将悬液混匀。


常用的卵巢癌细胞系有SKOV3、ID8、A2780、HO-8910、ES-2、COC1、OCCAR-3、CAOV-3等。


2)组织块移植:是将新鲜切除的肿瘤标本边缘生长较快的部分接种于裸鼠皮下。常用穿刺针法,首先抓取动物,固定,选好皮下种植部位并消毒,用合适型号的套管针将剪好的瘤组织移至小鼠皮下。组织块移植法可避免细胞污染、接种时间长等导致细胞活力低下等情况,故在大批量卵巢癌模型建立中较多选用此方法。


组织移植法的优点是所移植的肿瘤能够保持原有的结构,并且能长时间存活,避免了宿主细胞干扰或浸润。但其缺点也是未能准确反映肿瘤的生长和扩散。 


移植性卵巢癌动物模型的优点:成瘤率高、实验周期短、不稳定因素少、可重复性强,用于抗癌药物的筛选,个体差异较小,成功率高,可传代移植。


移植性卵巢癌动物模型的缺点:对移植的肿瘤稳定性要求较高,无法体现卵巢癌发生过程,较少用于卵巢癌发病研究。

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