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干货分享 | 你是否也有这个疑惑?qPCR提RNA不提DNA

定量PCR(qPCR)是一种在PCR反应中实时监测核酸扩增产物的方法。为什么qPCR提RNA不提DNA?

RNA更能反映gene的表达水平


依据中心法则,细胞内的DNA序列首先被转录成RNA分子,特别是信使RNA(mRNA),随后mRNA携带遗传信息,用于指导蛋白质的合成。mRNA的丰度和多样性是衡量基因表达水平的关键指标,它们直接关联到特定基因在特定时间和条件下的活性。与蛋白质相比,RNA的水平变化能够更快地反映基因表达的动态变化,因为RNA的稳定性相对较低,其水平变化可以迅速响应细胞内外部环境的改变。通过测量mRNA的表达水平,科研人员可以获得细胞在特定时刻基因活性的快照,这对于理解复杂的生物学过程和疾病机制至关重要。


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DNA序列信息相对稳定


DNA序列是生物体内遗传信息的稳定存储形式,它包含了构成生物体所有基因的核苷酸顺序。DNA分子的数量在细胞中保持相对恒定,仅在细胞分裂过程中进行复制,以确保遗传信息的准确传递给子代细胞。然而,DNA的这种稳定性也意味着,单纯测量DNA的量并不能直接提供关于基因在特定时刻的活性状态或其表达活性的信息

为什么qPCR不直接扩增RNA?


RNA的不稳定性:RNA分子比DNA分子更不稳定,更容易被细胞内的RNA酶降解。直接扩增RNA可能会增加其被降解的风险,导致实验结果的不准确。


逆转录过程:在qPCR中,通常首先使用逆转录酶将RNA转换成cDNA(互补DNA)。这样,RNA的不稳定性不再是问题,并且cDNA的稳定性和DNA的扩增效率使得实验更为可靠。


实验简便性:逆转录生成cDNA后,可以使用标准的qPCR协议进行扩增和定量,这简化了实验流程并提高了操作的一致性。


避免干扰:直接扩增RNA可能会受到RNA二级结构的影响,这可能会阻碍引物的结合和聚合酶的活动。通过逆转录成cDNA,可以减少这种结构对扩增过程的潜在影响。


提高灵敏度和特异性:cDNA的合成还可以提高qPCR的灵敏度和特异性,因为cDNA的合成可以包括去除原始RNA模板的步骤,这有助于减少扩增过程中的背景噪声。


技术兼容性:逆转录产生的cDNA可以用于多种下游应用,包括qPCR、克隆、测序等,这增加了实验的灵活性。


定量准确性:通过逆转录生成cDNA,可以更准确地对RNA分子进行定量,因为cDNA的扩增效率通常比直接扩增RNA更为一致。

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