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干货分享 | 蛋白定量的3种常用方法

蛋白质含量可从它们的物理化学性质,如折射率、比重,紫外吸收、染色等测定而得知;或用化学方法,如定氮、双缩脲反应、 folin-酚试剂反应、BCA法等方法来测定。


一、比色法


蛋白定量常使用的方法是比色法,通常用于总蛋白的定量分析。根据蛋白和比色试剂的结合,可以将比色法分为:蛋白-染料结合法和蛋白-铜螯合化学试剂法。前者对应的典型蛋白定量比色法是考马斯亮蓝G250染料结合法,后者则包括双缩脲法,Lowry法,二喹啉甲酸(BCA)法。


1、Bradford法

Bradford法原理是在酸性溶液中,考马斯亮蓝G250通过与蛋白质中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合,使染料的最大吸收峰位置由488nm变为595nm,颜色从棕红色变为蓝色。结合到蛋白质分子上的染料数与蛋白所带正电荷成正比,通过颜色的强弱即可测定蛋白质浓度的高低,因此可以用该方法来对蛋白进行定量。


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因染料主要与蛋白质中精氨酸和芳香族氨基酸残基相结合,且两者在各种蛋白质含量不同,故用于不同蛋白质测定时有较大偏差,另外范德华力和疏水作用也会影响蛋白与染料的结合。


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Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响,如:K⁺、Na⁺、Mg²⁺离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP和β-巯基乙醇等。但需要注意的是:由于高浓度洗涤剂会影响检测结果的可靠性,必须确保样品中的SDS的浓度低于1%,Triton X-100低于0.1%,Tween20,60,80低于0.06%。


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检测蛋白浓度的考马斯亮蓝和染色PAGE胶的考马斯亮蓝不是同一种物质,前者采用考马斯亮蓝G250,后者采用考马斯亮蓝R250;G250和R250分子基本骨架一样,但是G250多了两个甲基,与蛋白反应迅速,染胶慢且脱色困难,故用于蛋白定量;R250与蛋白反应较缓慢,染胶较快且易于洗脱,故用于PAGE胶染色。



2、 BCA法

BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸)法测定蛋白的原理:二价铜离子在碱性条件下可以被蛋白质还原成一价铜离子,一价铜离子和含有BCA的溶液相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子,形成紫色的反应复合物。


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该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性,吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系,并于标准曲线对比,因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。


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BCA法容易受到能与铜离子反应的螯合剂例如EDTA,还原性试剂(β-巯基乙醇)以及蛋白质内半胱氨酸等的影响。


3、双缩脲法

双缩脲是三分子的脲经180℃左右加热,放出一份子氨后得到的产物,在强碱性溶液中,双缩脲与硫酸铜可形成紫色络合物(肽链中的氮原子和铜离子配价结合),称为双缩脲反应。


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紫色络合物颜色的深浅与蛋白质的含量成正比,而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围1-10mg蛋白质。


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双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈色反应,使其有利于对蛋白质纯化早期步骤的测定。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂,例如Tris缓冲液,因为它们给予阳性呈色反应。Cu²⁺也容易被还原,有时发现出现红色沉淀。


4、Folin-酚试剂法(Lowry法)

用于蛋白质测定的Lowry反应是双缩脲方法的发展,第一步涉及到在碱性溶液中铜-蛋白质复合物的形成(蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应),Folin-酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被铜-蛋白质复合物中蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。在一定条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比,由此可测定蛋白质的含量。


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这个测定法较双缩脲法灵敏得多。对双缩脲反应发生干扰的离子同样容易干扰Lowry反应,而且对后者的影响还要大得多。所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用。

二、紫外法


蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。


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此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。



1、280nm的光吸收法

因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收,且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大,因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。


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测定时,将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中,用配制蛋白质溶液的溶剂(水或缓冲液)作空白对照,在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1-1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿,盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时,A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。


2、280nm和260nm的吸收差法


核酸对紫外光有很强的吸收,在280nm处的吸收比蛋白质强10倍,但核酸在260nm处的吸收更强,其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍,而蛋白质则相反,280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。


通常:纯蛋白质的光吸收比值:A280/A260=1.8;纯核酸的光吸收比值:A280/A260= 0.5。含有核酸的蛋白质溶液,可分别测定其A280和A260,由此吸收差值,用经验公式(蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260),即可算出蛋白质的浓度。


3、215nm与225nm的吸收差法

蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时,可用215nm与225nm吸收值之差,通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。


用已知浓度的标准蛋白质,配制成20-100mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液,分别测定215nm和225nm的吸光度值,并计算出吸收差:吸收差d=A215-A225。以吸收差d为纵座标,蛋白质浓度为横座标,绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差,即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。


4.肽键测定法

蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱,与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50-500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液,测定238nm的光吸收值A238,以A238为纵座标,蛋白质含量为横座标,绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。


本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物,如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐,无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂,可先将样品蒸干,或用其他方法除去干扰物质,然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。

三、凯氏定氮法


1、原理

蛋白质是含氮的有机化合物。样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出,而样品中的有机氮转化为氨;氨与硫酸结合生成硫酸铵。加碱蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数(如乳及乳制品换算系数为6.38),即为蛋白质的含量。


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2、过程


1)消化

浓硫酸具有脱水性,使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又具有氧化性,可将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳,硫酸则被还原为二氧化硫。二氧化硫使氮还原为氨,本身则被氧化为三氧化硫,氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。


蛋白质+13H₂SO₄→(NH₄)₂SO₄+6CO₂+12SO₂+16H₂O


消化时加入的硫酸铜是作催化剂,以加速分解反应,还可以加入氧化汞、氧化铜等作催化剂,为防止汞的污染,通常用硫酸铜较多。如果以汞或汞化合物作催化剂,则消化和加碱后,形成汞氨化合物。此化合物在蒸馏时不能完全分解,在这种情况下,必须加入锌粉或硫代硫酸钠或硫化钠,使汞氨化合物分解。


C+2CuSO₄→Cu₂SO₄+SO₂↑+CO₂↑

Cu₂SO₄+2H₂SO₄→2CuSO₄+2H₂O+SO₂


有机物消化完后,溶液具有清澈的硫酸铜的蓝绿色,同时硫酸铜在下一步蒸馏时可作碱性反应的指示剂。


在消化过程中添加硫酸钾,与硫酸反应生成硫酸氢钾,是为了提高溶液沸点,从而提高反应温度,加速反应过程。此外,也可以加硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点。


在消化过程中,随着硫酸的不断分解、水分的不断蒸发,硫酸钾的浓度逐渐增大,沸点升高,加速了对有机物的分解作用。


加入过氧化氢,是利用其氧化性,以加快反应速度:2H₂O₂→O₂+2H₂O


2)蒸馏

在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性,硫酸铵在碱性条件下释放出氨,通过加热蒸馏,氨随水蒸气蒸出:(NH₄)₂SO₄+2NaOH →2NH₃+Na₂SO₄+2H₂O


3)吸收

加热蒸馏时放出的氨可用硼酸溶液进行吸收:2NH₃+4H₃BO₃→(NH4)₂B₄O₇+5H₂O


4)滴定

待吸收完全后,用硫酸或盐酸标准溶液滴定生成的硼酸铵,属于盐类的滴定。硼酸为极弱的酸,在滴定中并不影响所用指示剂的变色反应。


(NH₄)₂B₄O₇+H₂SO₄+5H₂O→(NH₄)₂SO₄+4H₃BO₃

(NH₄)₂B₄O₇+2HCl+5H₂O→2NH₄Cl+4H₃BO₃


5)计算

根据硫酸或盐酸溶液消耗的体积,计算总氮含量,再乘以蛋白质系数(乳及乳制品换算系数为6.38),即为粗蛋白的含量。

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