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干货分享 | 菌种保藏的常见方法汇总

菌种保藏是指保持微生物菌株的活力和遗传性状的技术。微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡,因而常常造成菌种的衰退。菌种保藏的目的就是使菌株存活、不丢失、不污染杂菌、不发生或少发生变异,保持菌种原有的活性和各种特征。菌种保藏的基本原理是使微生物的生命活动处于半永jiu性的休眠状态,也就是将微生物的新陈代谢作用限制在最低范围内。


实验室常用的保菌方法有:甘油保菌法、斜面保菌法、穿刺保菌法、液体石蜡覆盖保藏法、沙土保藏法、冷冻干燥法。微基生物在以上几种菌种保藏方法的基础上,开发出了保菌效果更好瓷珠保菌法。


一、甘油保菌法


此方法适用于菌种的中长期保藏,保藏时间可在1年以上。由于甘油本身十分粘稠,很难定量,因此一般将甘油和生理盐水按1:1的比例配成终浓度为50%的甘油溶液。使用时,按50%甘油:菌液=1:1的比例混合,使甘油终浓度在20-30%即可,甘油浓度过高或过低都不利于菌种保藏。将甘油菌种转移至-80℃冰箱长期冻存。需要取用菌种的时候,将冻存管放在37℃水浴中快速解冻,直到菌种完全融化,此时可取出菌种进行实验。


此方法适用范围广,操作简单,保藏期长,菌种不容易发生变异。

二、斜面保菌法


将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌充分生长后转移至4℃冰箱中保藏。保藏的时间根据微生物的种类而不同,一般霉菌、放线菌及产芽孢的细菌保存2-4个月就需要移种一次,酵母菌为两个月,而细菌最好一个月移种一次。需要取用菌种的时候,可用接种环在斜面上挑取少量菌体进行接种。


此方法的优点是操作简单,使用方便,不需特殊设备,能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异或污染杂菌等。缺点是保藏期短,菌种容易变异,因为培养基的物理和化学性质不是严格恒定的,屡次传代会使微生物的代谢发生改变,且此方法污染杂菌的机会较高。

三、穿刺保菌法


准备一管半固体培养基,用接种针挑取菌种,自半固体培养基的中心垂直刺入,直至接近试管底部,但不要穿透,然后沿原穿刺线将接种针退出,于4℃冰箱保存。此方法同斜面保菌法一样需要定期移种。

四、液体石蜡覆盖保藏法


此方法是斜面保菌的辅助方法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌充分生长后注入无菌液体石蜡,使其覆盖整个斜面,再直立放置在4℃冰箱中保藏。液体石蜡可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡,同时可以让菌体与空气隔绝,减弱菌种的代谢作用,延长保藏时间。需要取用菌种时,用接种环从斜面上挑取少量菌种即可。


此方法的优点是操作简单,不需要特殊的设备,且不需要频繁移种,保藏时间较长。缺点是保存时必须直立放置,占用空间较大。

五、沙土保藏法


将培养好的菌种与无菌沙土混合,使菌体吸附在沙土载体上,干燥后转移至4℃冰箱保存。需要取用菌种的时候,取出少量沙土颗粒即可。


此方法操作简单,菌种的保藏时间长。

六、冷冻干燥法


将菌种冷冻,在减压下利用升华作用去除水分,使细胞的生理活动趋于停止,从而使菌种长期维持存活的状态。需要取用菌种的时候,用无菌水或培养基重悬菌体,将菌悬液转移至固体培养基平板上进行培养。


此方法适用于菌体的长期保存,但是相关的设备和操作相对其他几种保藏方法都比较复杂。

七、瓷珠保菌法


微基生物在以上几种保藏方法的基础上开发出了瓷珠保菌法,相对传统的保藏方法保菌的效果更好,而且取用方便,可降低菌种因反复冻融而受到的伤害。


瓷珠冻存管中包含12颗磨砂瓷珠和菌种保存液。挑取对数生长期的菌种转移至冻存管中,上下颠倒混匀,此时菌种会均匀分布在保存液中。用移液器吸出保存液,此时在表面张力的作用下,每颗瓷珠表面都会覆盖一层保存液,而菌种就保存在这层保存液中。将含有菌种的冻存管转移至-80℃冰箱即可长期冻存(一般可保存约1年)。


需要取用菌种时,从-80℃冰箱中取出冻存管,轻轻摇晃使瓷珠分散开,挑取一颗瓷珠接种至培养基平板上进行划线培养,或接种至液体培养基中进行摇菌培养。接种完成后,迅速将冻存管放回冰箱中。


针对厌氧菌株,我们也能够提供含有还原剂的厌氧性保存液,并对菌种采用真空包装,避免菌种因接触氧气而死亡。


菌种保藏的方法很多,但原理大同小异。


首先要挑选优良纯种。利用微生物的孢子、芽孢及营养体;


其次,根据其生理、生化性,人为创造低温、干燥或缺氧等条件,抑制微生物的代谢作用,使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态,从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的形状,防止变异。不管采用哪种保藏方法,在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化。


短期:斜面保藏

斜面保藏是目前最普遍的短期保藏法,操作简单,使用方便,但需定期接种。因此工作量较大,而且传代次数多易发生变异,因此,仅适用于短期经常使用的菌种。


1. 配制培养基,营养成分浓度稍低为宜,特别是糖类尽可能降低,产酸菌种,则应添加少量碳酸钙;


2. 斜面装液量,斜面以倾斜后不超过试管长度 1/2 为宜;


3. 斜面培养,温度较最适稍低,时间较最适略长;


4. 生长完成后,密封置于 2~8℃的冰箱中保藏。每传代一次,霉菌、放线菌及有芽孢的细菌可保存 1~3 个月,酵母菌 2 个月,细菌1个月。


活化使用:

将斜面从冰箱中取出,细菌挑取菌落增菌,或霉菌切块传代培养,培养好即可使用。


长期:冷冻保藏

冷冻保藏是目前使用较为广泛的长期保藏法之一,适用于所各类微生物,较之于斜面保藏,减少了工作量,延长了保藏时间。


1. 准备斜面或平板新鲜培养物一个,10%的无菌甘油溶液;


2. 用甘油溶液将菌体或孢子洗脱下来,形成菌悬液;


3. 菌悬液分装,冻存管装液 1mL/支,后置于程序降温盒;


4. 将程序降温盒置于-80℃冰箱冻存;


5. 可保藏 1-2 年。


活化使用:

1. 将冻存菌株置于冻存盒中取出,准备水浴溶解,切勿常温融化;


2. 将菌株迅速置于水浴速溶,细菌 40℃,真菌 30℃,约 2min 全部溶解后接种到适宜培养基;


3. 采用适宜条件培养完成即可。

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