服务
  • 服务
  • 产品
搜索

010-80842119 

创新研究 赋能医药!

首页 >> 行业动态 >>经验技巧 >> 干货分享 |PCR和凝胶电泳实验结果常见问题及原因分析
详细内容

干货分享 |PCR和凝胶电泳实验结果常见问题及原因分析

为了排除某些因素对PCR结果的影响,PCR实验需要对照实验。PCR的阳性对照是Marker,推测PCR产物长度,判断PCR产物是否是目的片段。PCR的阴性对照是PCR的空白管,除了模板不加之外,其成分与其他管一样,证明没有其他模板污染。


由于目前所用的PCR仪器自动化程度较低,操作步骤较为繁杂,人为因素大,这就不可避免地会出现不同程度的误差。轻微的污染、加量的误差等均可导致结果较大的差异,甚至阳性和阴性出现两种迥然不同的结果。在分析测定工作中系统误差产生的原因主要有:方法误差、仪器误差、人员误差、环境误差、试剂误差等。本期我给大家搜集了一些平时经常性遇到的一些问题,希望对大家有所帮助。


要分析遇到的问题,除了考虑必要的仪器外,需要明确PCR(聚合酶链反应)的基本要素:


引物:这些是特别设计的短DNA序列,作为DNA合成的起始点,针对目标DNA的两端进行互补配对。引物长度一般在20到30个核苷酸之间。


DNA聚合酶:以Taq聚合酶为代表的酶类,负责新DNA链的合成。Taq聚合酶能够在引物附着的地方开始工作,通过逐一添加核苷酸来延长DNA链。这种聚合酶能够耐受PCR过程中必需的高温条件,这是因为它来源于能在热水环境中生存的微生物。


脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs):这些分子提供了新DNA链合成的原料,包括四种类型:dATP、dCTP、dGTP和dTTP。在PCR过程中,Taq聚合酶利用这些dNTPs来逐步构建新的DNA链。


目标DNA提取:实验开始之前,首先需要从样本中提取出所要研究的DNA片段。


缓冲溶液:提供适宜的反应环境,确保PCR反应能够有效进行。


氯化镁(MgCl2):作为Taq聚合酶活性的辅助因子,对于酶的功能至关重要。


1.耗材选择不当对实验结果造成很大的影响

PCR耗材一般都是聚丙烯(PP)材质,因其为生物学惰性材料,表面不易于粘附生物分子,且有着良好的化学耐性,及温度耐受性(可121℃高压灭菌,也可以承受热循环过程中的温度变化)。这些材料通常会与试剂或者样品直接接触,因而在生产制备过程中需要选用高质量的材料和良好的加工工艺。


PCR管的体积大多数都可以满足PCR反应要求。但是在满足实验要求的基础上,优先推荐选用低容管。因为低容反应管有着较小的上方空间,可提高热传导率并降低蒸发。而且在加样时,需要避免加样过量或过少。过量会导致热传导率下降,溢出及交叉污染,而加样过少可能会造成样品蒸发损失。


2.假阴性(无扩增产物)——现象:阳性对照有条带,而样品则无

原因:模板含有抑制物,含量低;缓冲液(Buffer)对样品不合适;引物设计不当或者发生降解;反应条件:退火温度太高,延伸时间太短。


对策:纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量;更换Buffer或调整浓度;重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物;降低退火温度、延长延伸时间。


3.非特异性扩增 ——条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带

原因:引物的特异性不强、提取模板DNA中可能会有非靶基因性同源序列;模板或引物浓度过高;酶量过多;Mg2+浓度偏高;退火温度偏低;循环次数过多。


对策:重新设计引物;适当降低模板或引物浓度;适当减少酶量;降低镁离子浓度;适当提高退火温度则减少与同源性非靶DNA的互补程度;减少循环次数。


4.拖尾——产物在凝胶上呈模糊不清状态(弥散)

原因:模板不纯;引物浓度不够优化;Buffer不合适;退火温度偏低;.酶量过多;dNTP、Mg2+浓度偏高;循环次数过多。


对策:纯化模板;对引物进行梯度稀释;更换Buffer;适当提高退火温度;适量用酶;适当降低dNTP和镁离子的浓度;减少循环次数。


5.假阳性——空白对照出现目的扩增产物

原因:出现假阳性最大的可能性是污染有非样品性靶基因,特别是进行大量检测或经常性针对同一种靶基因的扩增试验时,如稍不慎重,就会导致样品间的交叉污染及实验室的“随带性”污染。出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列,这在基因组DNA中扩增特异片段时应特别注意,对于样品间的交叉污染,实验室的随带污染、避免假阳性关键在于提高警惕慎重操作。


对策:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用;各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存 。

标题
更多

订购方式

经销商申请

帮助中心

关于我们

MDL手机站
MDL科研助手
感谢您的光临,祝您生活愉快,科研顺利!
seo seo