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【实验方法】病理染色之Van Gieson染色实验

1.原理:

VG染色法是利用两种阴离子染料混合或先或后作用而完成鉴别染色的。

胶原纤维呈红色(被丽春红所染)肌纤维呈黄色(被苦味酸所染),这与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关。组织的渗透性,取决于组织的结构密度,如细致观察,会发现组织和细胞成分都是多孔的构造。不同的组织和细胞成分,它们的空隙大小是不同的,空隙的大小,决定了组织的渗透性,如空隙小,组织结构致密,渗透性低;空隙宽,组织结构疏松,渗透性高。如已固定的组织用一系列阴离子水溶性染料先后或混合染色,则可发现红细胞被最小分子的阴离子染料着染。由此说明红细胞对阴离子染料的渗透性最小。肌纤维与胞质次之,而胶原纤维具有最大的渗透性。

根据组织不同的渗透性能,选择分子大小不同的阴离子染料进行染色,便可把不同组织成分显示出来。染料分子的大小,主要由其分子量来体现。一般来说小分子量者易于穿透结构致密,渗透性低的组织,而大分子染料只能进入结构疏松,渗透性高的组织。常用胶原纤维染色而几种阴离子染料的分子量由小到大分别是:

苦味酸(黄色),分子量229.11

橙黄G(橙黄色)分子量452

丽春红(红色)分子量480.42

酸性品红(红色)分子量585.53

苯胺蓝(蓝色)分子量737.72

亮绿(绿色)分子量792.72

甲基蓝(蓝色)分子量799

因此,在Van Gieson氏法中,苦味酸染红细胞和肌纤维,酸性品红染胶原纤维。

2.试剂配制:

(1)Ponceau染色液:0.5%ponceau(丽春红S)水溶液10-15ml,苦味酸饱和水溶液85-90ml。

(2)Victoria Blue’B染色液:Victoria Blue’B(维多利亚蓝B)0.5g,70%乙醇100ml。

3.染色步骤:

(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。

(2)70%乙醇稍洗后,浸入Victoria Blue’B染色液中15ml。

(3)95%乙醇中分化数秒钟。

(4)用蒸馏水洗2次

(5)用Ponceau染色液滴染5min。

(6)直接用无水乙醇分化与脱水。

(7)二甲苯透明,中性树胶封固。

(8)显微镜观察。

4.样本说明:

(1)石蜡切片

取材:1、组织离体后需及时固定;2、组织标本不宜过大、过厚。

固定:1、固定液:10%福尔马林(4%多聚.甲醛)或10%中性甲醛;2、用量:一般固定液的量与组织体积比为10:1~20:1;3、固定:适宜的固定时间,主要根据材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。

保存:切片经60℃烤片3-5小时后,可于常温或4℃干燥保存。

(2)冰冻切片

取材:取材后需立即置于超低温冰箱或液氮中保存。

固定:样本冰冻切片后,应立即放入甲醇、丙.酮、95%酒精、4%多聚.甲醛等固定液中固定。

保存:固定好的切片自然风干,密封后置于-80℃、-20℃保存,尽快用于后续实验。

(3)细胞块石蜡切片

细胞量较多的样品,可离心分离所需细胞,用中性甲醛固定后制作成琼脂细胞块,然后按照制作石蜡切片的操作流程进行切片。

(4)细胞爬片

在孔板里做的细胞爬片,爬片取出后,用PBS洗涤2次(根据研究目的,PBS洗涤可选择不做),用4%多聚.甲醛4℃固定15分钟,将表面液体吹干,置于-20℃保存。若在短时间内即开展实验,可在加固定液后,于4℃冰箱中放置一段时间。

(5)细胞涂片

细胞涂片常用的固定液有95%酒精(最为常用)、酒精-冰醋.酸液、Ethyl ether-酒精液和Carney’s液等。

5.注意事项:

(1)胶原纤维切片的厚度需6um,使之对比清晰。

(2)Victoria Blue’B染色液应盛染色缸内,进行浸染色。

(3)Ponceau染色后,不能与水接触,直接用无水乙醇冲洗脱水。

(4)在Van Gieson氏染色,苦味酸与酸性品红浓的比例若不恰当,如苦味酸的浓度太高,小分子量染料苦味酸占优势,则结构致密的胞浆,肌纤维和结构疏松的胶原纤维都会被苦味酸所着染。

6.结果:

鲜红色:胶原纤维;黄色:肌纤维、细胞质、红细胞;蓝褐色:胞核

VG染色 (1).png

卵巢组织:胶原纤维呈红色;血管壁肌层呈黄色;细胞核呈黑色。

VG染色 (2).png

心肌梗塞(2月),坏死心肌被染成红色的纤维组织所代替,黄色区域为残留的心肌纤维。

7.应用

(1)来源于间胚叶的肿瘤,如纤维瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、神经纤维瘤甚至它们的肉瘤等都产生一定的纤维,这些纤维在H-E染色中都染成红色而难以区别。通过用上述方法染色,一般可区分出该肿瘤组织是胶原纤维源性,还是肌源性,或者是神经纤维源性。对于后者,有时还需加染磷钨酸苏木素来协助诊断。

(2)在慢性炎症,机化和瘢痕形成中,可随病理过程的发展而出现胶原纤维。在早期,H-E染色切片中的这些纤维往往和纤维蛋白很难鉴别,通过胶原纤维染色则可证实。如慢性肾小球肾炎的肾小球纤维化后,V.G.染色呈红色。大叶性肺炎或血栓发生机化后,原有的纤维蛋白灶内出现胶原纤维,V.G.染色呈红色。风湿性肉芽肿已静止时,阿啸夫氏(Aschoff's)。巨细胞消失,病灶内的纤维被胶原纤维取代,V.G.染色也呈红色。胃、十二指肠溃疡愈复时,在渍疡底部出现胶原纤维构成的疤痕,慢性阑尾炎时阑尾壁出现的纤维化,肝硬化时胶原纤维的增生,这些用V.G。染色也都染成红色。

(3)血管壁的胶原纤维染色对病理诊断也很重要。良性高血压,小动脉的玻璃样变,V.G.染色阳性。恶性高血压病时,小动脉管壁为纤维素样坏死,V.G.染色阴性而纤维素染色阳性

(4)V.G.染色对是高血压性血管疾患还是淀粉性样变血管损害的鉴别也很重要。H-E染色的玻璃样变和淀粉样变有时很难区别,用V.G.染色和淀粉样物质染色则可作出区别。如高血压性肾固缩其小动脉壁V染色呈红色。而淀粉样物质沉积的小动脉壁V.G.染色呈黄色。



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