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【实验方法】决定凝胶迁移实验成功的3要素

凝胶迁移(EMSA)实验是研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,用于验证基因的反式作用因子与顺式作用元件如转录因子与启动子的互做关系。可用于定性和定量,也可用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

将蛋白或蛋白提取液与探针混合孵育,用凝胶电泳的方法分离混合液的各个组分,探针迁移速率大,蛋白-探针复合物因为蛋白质的存在,迁移速率变慢。因此,根据电泳带的位置判断探针是否能和蛋白结合。

探针设计

经典的EMSA实验使用32P放射性同位素标记探针,但目前常用荧光、地高辛或生物素等非放射性标记。探针的序列根据已有的文献或前期实验的结果确定,注意探针不要有复杂的二级结构和自身互补序列,探针长度一般30-100碱基。

实验步骤

1.探针标记

荧光标记在探针合成时加入,地高辛或生物素目前已有商品化的探针标记试剂盒,按照试剂盒进行操作即可。探针标记后纯化。

2.蛋白样品

EMSA实验的蛋白样品可以是纯化的蛋白,用于确定探针是否可以与确定的蛋白结合;也可以是细胞或细胞核蛋白提取液,

3.结合反应

1)蛋白样品2-5μg,poly d(I-C)1μL,5X结合缓冲液2μL,灭菌超纯水将总体积补至9μL。混匀后,冰浴5分钟。

2)加入探针1μL,室温(20-25℃)孵育30分钟。

4.电泳

1)配制6.5%非变性聚丙烯酰胺胶,加样前先在4℃、0.5X TBE中预电泳10-15分钟。

2)加样,4℃条件下电泳大约1小时,至指示带接近凝胶底部。

5.转膜

凝胶、尼龙膜用0.5X TBE浸泡后在4℃条件下转膜。

6.检测

根据探针的标记,按照相应的步骤显色。

典型的EMSA实验结果如下:

EMSA实验

图片来源:美国signosis公司

实验设计

1.验证性EMSA

用于验证特定的序列是否可以与蛋白结合,但不能确定与探针结合的蛋白。

2.竞争性EMSA

在反应体系中同时加入未标记的探针,如果探针与蛋白的结合是特异的,与仅加入标记探针的反应相比,蛋白-探针复合物的信号会降低甚至消失。

3.超迁移EMSA

超迁移EMSA一般应该在EMSA实验已经成功的基础上进行。

如果蛋白样品不是纯化蛋白而是混合物,验证性和竞争性EMSA都不能鉴定出与探针结合的蛋白。在反应体系中加入特定的蛋白抗体,抗体与蛋白-探针复合物结合,抗体-蛋白-探针复合物的电泳迁移变慢,因此,可以确定探针是否与特定的蛋白结合。

附:蛋白DNA结合缓冲液配方(5X)

成分用量(μL)
甘油500
Tris(1M,pH8.0)250
BSA(10mg/mL)125
NaCl(5M)30
EDTA(0.5M,pH8.0)10
DTT(1M)10
总体积1000

EMSA实验

MDL 百奥思科


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