Small-interfering RNAs,是一种21-25bp的短干扰RNA。这种RNA可以通过同源互补序列的mRNA为靶目标使特定的mRNA高效特异性降解的现象,因此又被称为RNA干扰(RNAi)。RNAi的应用包括功能基因组学,药物靶筛选,细胞信号传导通路分析等。

siRNA与蛋白组装成诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)(一种由siRNA与Argonaute蛋白和Dicer酶复合形成的复合物),然后RISC识别靶位点,剪切并降解mRNA实现转录后水平的基因沉默。

目前为止制备siRNAs的方法主要包括化学合成、体外转录、长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)、siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达等五种方法。除了方法3以外,其他的方法都在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列。

SiRNA设计如何选择选择靶点序列十分重要,通常靶点序列需要19~21个碱基,GC含量的范围在35%-55%之间,避免出现超过4个连续的A或T,尽量设计在CDS区。此外,设计靶点序列要注意与非目的基因连续匹配的碱基数不能超过15bp。

设计靶序列时首先需要登录NCBI获取Gene ID、Genbank ID、基因的序列、转录本之间的同源性。

例如:在NCBI上搜索小鼠的HO-1基因。

Gene ID为15368.

Genbank ID为NC_000074.6,有两条转录本,此外还需要获取基因的序列的FASTA格式。

(NC表示完整的基因组分子序列,每个转录本Genbank ID共有的方块即为同源区。)

然后采用Invitrogen RNAi Designer进行设计,首先打开Invitrogen网站

http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/。

然后选择“siRNA”,输入Genbank ID或者核酸序列的FASTA格式贴入对话框,然后step2默认编码区;step3选择no blast;step4 GC含量默认35%-55%;step5位设计原则保持默认选项,点击“RNAi Design”。

网站默认给出十个靶点及对应信息,在得到靶序列以后,再将在体外得到siRNA序列通过细胞转染的方式导入细胞内。通常在实际操作中,每个基因需要设计并测试两到四条siRNA序列。

因此,要确定每一个siRNA基因敲除的精确水平是一个严格要求的过程,在后续的研究中可以进行融合报告系统为基础的实验,在这种系统中,可以利用包含靶标序列和融合报告基因以及用于标准化的对照基因的质粒,联同靶标特异性siRNAs共转染进细胞中,最终加速在不同的合成的siRNAs中识别的有效的siRNAs。

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