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【实验方法】明胶酶谱法检测 MMP 活性

细胞外基质( extracellular matrix , ECM )是由大分子构成的错综复杂的网络。为细胞的生存及活动提供适宜的场所,并通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)可以降解细胞外基质成份,需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子,是一组具有许多共同生化性质的可降解细胞外基质的酶。基质金属蛋白酶2(MMP2)主要降解IV型胶原,基质金属蛋白酶9(MMP9)可以降解弹性蛋白、胶原蛋白、明胶和纤维蛋白等细胞外基质的成分。基质金属蛋白酶的失调是多种疾病发生、发展的重要机制之一。

明胶酶谱实验可以检测MMP2和MMP9的活性,是分子生物学的常用实验技术之一。先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离,然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,最后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

实验流程如下:

   一.样品制备   

组织或细胞的蛋白样品制备可用常规的方法,但需注意蛋白裂解液中不能加入EDTA,因为EDTA是金属离子螯合剂,可以络合Zn2+,抑制MMP的活性;也不能加入β-巯基乙醇或DTT,因为会导致蛋白的二硫键被打开,蛋白不能复性。推荐用PBS或Tris缓冲液(pH7.5)作为蛋白提取的缓冲液,可以加入0.5%的PMSF。

   二.SDS-PAGE   

1)SDS-PAGE 凝胶配制


10%分离胶5%浓缩胶
总体积10mL6mL
30%丙烯酰胺2.0mL0.75mL
1.5M Tris-cl (PH 8.8)2.5mL/
1.0M Tris-cl (PH 6.8)/0.76mL
10%SDS0.1mL0.006μl
10%AP0.1mL0.06mL0.1mL0.006μl
TEMED8μl0.006μl
明胶(10mg/mL)1.0mL/
超纯水4.5mL4.5mL

明胶母液配制后可在4℃保存,最好不超过1周。

2)电泳

4℃、常规电泳即可,可以适当延长电泳时间,至溴酚蓝完全出胶。上样量一般为50μg,可根据实验的具体情况和预实验结果调整。

注意:①上样缓冲液中不能加入β-巯基乙醇或DTT,原因同上。②样品与上样缓冲液混合后直接上样,样品不要煮沸,高温会导致蛋白不可逆的失活。

  三.反应和显色  

1)将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100,50mM Tris-HCl,5mM CaCl2,1μM ZnCl2,pH7. 6)中振荡洗脱2次,每次40分钟。

2)漂洗液(50mM Tris-HC,5mM CaCl2,1μM ZnCl2)漂洗2次,每次20分钟。

3)凝胶置于孵育液(50mM Tris,pH7.5,150mM NaCl,10mM CaCl2,1μM ZnCl2,0.02% Brij-35)中37℃ 孵育42-48小时。

4)染色液(考马斯亮蓝染色液)染色3小时。

染色液配方表

甲醇乙酸考马斯亮蓝(R250)
30%10 %0.5%

5)脱色液A、B、C分别脱色。

脱色液配方及脱色时间


甲醇乙酸脱色时间
A30%10 %0.5小时
B20%10 %1小时
C10 %5%2小时

脱色时间可以根据观察到的脱色效果调整。


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