质粒是基因工程中常用的载体,也是生物学实验的基本要素,正确的阅读质粒图谱是实验的第一步,但是每当拿到一个质粒图谱,第一反应就是一脸懵,这是什么玩意?这些ori、RBS、tet是什么鬼?这些箭头代表什么,转录的方向吗?为什么都不相同,不会“撞车”么?这玩意究竟怎么看啊?为了解决这一难题,准确无误的阅读质粒图谱显得很关键,对你的实验会起到事半功倍的效果。

但是如何阅读质粒图谱,下面就开始进行详细介绍:

一、具体步骤:

第一步:先了解质粒的基本组成元素,Ori复制起始点、抗性基因有哪些、多克隆位点在哪里,有哪些酶切位点?有哪些荧光标记或蛋白标签序列?

第二步:看质粒是否是表达载体,如果是,那就必定有这些原件:启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。

第三步:弄清楚方向。为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针?那其实是代表两条DNA链,即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的某些基因在另一条链上。当然,最重要的是要弄清楚目的基因插入那一段(从T7启动子到终止子那一段)的方向,即下图黄色圈圈所示的箭头方向,其它的大可以忽略。

二、看Ori(复制起始原点)的位置:

对于一个质粒,首先要确定它的性质和类型,因为不一样的类型它的特点也是不一样的。我们首先可以根据Ori来了解质粒的类型,看它到底是原核、真核、穿梭质粒、慢病毒或者是腺病毒的载体。

那怎么判断呢,首先知道Ori是什么。其实就是它控制复制起始的位点,是在基因组上复制起始的一段序列。

Ori序列特点

1.复制原点处的A和T特别多,相对氢键少,不稳定,DNA容易解旋,因此就容易和引物结合,成为转录的起点或复制的起点。

2.Ori的箭头指复制方向,而质粒中其他元件的箭头一般指转录方向(正向)。

3.一般真核质粒会有两个Ori,属于穿梭质粒的一种,意思是一般这个质粒既有原核生物的Ori(方便在如大肠杆菌的细菌中复制、扩增),还有真核生物的Ori(方便其在真核细胞中表达)。下周四我们专门分享一下蛋白表达系统。

4.真核生物DNA分子通常有多个复制起始位点,而原核生物通常只有一个(这句话和质粒的Ori不相关,但是必须介绍,这涉及到如果你哪天可以自己合成质粒或者在构建质粒时,可以根据类型不同而你在Ori的选择方面会更灵活)。

5.ColE1(大肠杆菌素),这个质粒的真身就是从大肠杆菌中发现的天然的质粒,是个原核质粒,所以它的ori只需要1个。而慢病毒、逆转录病毒属于RNA病毒,只有1个复制起点。腺病毒也只有1个复制起点。

三、逆转录病毒质粒的示意例图 

1、筛选标记:

筛选标记也就是这个质粒的抗性,抗性又决定应该使用什么抗生素来培养、筛选。原核和真核的筛选又是不一样的。

原核筛选标记常用的是氨苄青霉素(Ampr)、氯霉素(Camr)、卡拉霉素(Kanr)、四环素(Tetr)等。

真核筛选标记用的是嘌呤霉素(Puro),G418,潮霉素β(Hygr)

原核和真核都可以的筛选标记,Zeocin、Blasticidin(通过干扰核糖体中肽键的形成来特异性抑制原核和真核生物的蛋白质合成),我们做衣原体制备的特殊质粒很多时候选择的是Blasticidin。

2、看多克隆位点(MCS):

所谓的MCS,也就是你可以接外源基因进入质粒的地方。在这里有多个限制性内切酶的单一切点,在这里就决定能不能放目的基因(也就是目的基因中是否包含此酶切位点)以及如何放置目的基因(就是你选择什么限制性内切酶来克隆)。

3、Gateway cloning

在Invitrogen的有一系列质粒系统不需要MCS,这个系统叫Gateway。

Gateway:

这个系统的质粒就长成上面那个样子。在质粒中有两个Att位点,这两个位点主要用于同源重组。在重新构建质粒的过程中,就是插入的目的基因通过同源重组取代Cm和ccdB两个基因。

这个系统的特性是什么样子的呢,首先CmR,这个是一个氯霉素抗性;其次ccdB(Control of cell death)基因是一个可以控制死亡的基因,原理就是如果质粒没有重组成功,ccdB蛋白会破坏细菌的DNA解旋酶,从而染色体降解死亡。如果质粒重组成功,则 ccdB基因表达受阻,所以细菌就可以生长。

4、看功能元件:

质粒的启动子,看这个质粒是什么类型的启动子。启动子是能够使基因进行转录的一段大小约为20bp的DNA序列。

(1)启动子特点:

1.可以被RNA polymerase识别,并启动转录。

2.启动子通常位于目的基因上游100-1000bp位置处,也有到2000bp的地方。

3.启动子是质粒非常重要的一个组成元件,它决定着目的基因可以在何种细胞中进行表达,也决定着这个基因转录的蛋白表达量。

(2)启动子与RNA polymerase的关系

1.DNA被RNA polymerase催化转录成RNA。

2.在原核生物如细菌中,只存在一种RNA polymerase。

3.真核生物中则有3种RNA polymerase,分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种。

4.这3种酶分别催化不同种类型RNA的转录,意味着3种酶识别不同的启动子。所以质粒上的启动子类型必须与目标RNA相对应。比如只是基因表达,那我们需要的是mRNA,那么质粒上就要有RNA  polymerase Ⅱ的启动子。

5.启动子需要与宿主细胞类型相对应。

6.细菌启动子与真核启动子是不可互用。

5、启动子类型:

启动有不同的类型,有些启动子可以一直工作(组成型启动子),而有些启动子是需要进行调控的(诱导性启动子)。

(1)组成型启动子

这类启动子用于组成型蛋白质的持续表达,不受时期、部分、环境的影响,这类启动子一般比较弱(因为较强后,它消耗的能量很多,会造成宿主的负担大,从而死亡)。比如在我们衣原体中最开始一类以脑膜炎球菌为启动子的质粒(nmP),下游的衣原体基因表达就特别低。

(2)诱导型启动子

这类启动子通常比较强,这类启动子受到外界条件诱导后开始工作。通常都是抗生素启动子,如Tet,Puo这种。比如衣原体的另一个质粒,在上述那个质粒上我们通过改造加了Tet的一个诱导型的启动子,可以外源性加不同浓度的Tet诱导下游的基因表达。

启动子的强弱主要是其与RNA polymerase相互作用的强弱及多少有关系。而强启动子通常直接或间接影响着RNA polymerase的产量。

(3)引物结合位点?

这个引物结合位点也就是一小段DNA片段,可以用来进行质粒的PCR扩增或者测序。比如T7载体。

6、是否带荧光?

我们有时候在做需要track一个蛋白在细胞中的location时,会在这个蛋白后面接一个融合荧光蛋白或其他。相对应的质粒上就会有一个荧光蛋白。

(1)外源DNA片段插入大小?

质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。通常,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。也就是说越难做克隆。

(2)是否含有表达系统元件?

也就是是否包含表达的那一套即启动子、增强子/沉默子、核糖体结合位点、克隆位点和转录终止信号。这个是用来区别克隆载体与表达载体的。

(3)增强子/沉默子

这个是针对真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强或减弱邻近基因转录过程的调控序列。其作用与位置或者方向均无关,也就是不管是位于所调控基因上游或下游均可发挥作用。

(4)核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs)

mRNA有核糖体才可以翻译。转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子

真核生物基因的最后一个外显子中有一个“AATAAA”的保守序列。而在此位点下游会有一段富含GT或T的序列,这两个部分共同构成我们熟知的poly(A)加尾信号。也就是我们的终止子