流式细胞术检测脾脏中Th17+细胞占比

关于Th细胞:

辅助性T细胞即Th细胞均表达CD4,因此又被称为CD4+T细胞。根据Th细胞所分泌的细胞因子不同可将其分为两型:一类是Th1细胞,能产生IFN-г,在介导细胞免疫应答中起重要作用;另一类是Th2细胞,能产生IL-4,与体液免疫应答有关。

Th17细胞是一类最近发现的CD4+T细胞,可分泌IL-17,与炎性反应和自身免疫疾病有关。活化的CD4+T细胞可通过经STAT3通路激活视黄酸相关核受体ROR-α和(ROR)-гt,进而分化为Th17细胞。

实验步骤:

1、单细胞悬液制备:将脾脏组织置于铁质滤网,均匀研磨至脾脏细胞充分脱落,用PBS将滤网上粘连的脾脏细胞进行冲洗,收集洗脱下来的脾脏细胞。将小鼠腿骨进行清理,清除肌肉组织,仅留腿骨。用剪刀将小鼠腿骨两端进行剪切,用注射器吸取PBS对小鼠腿骨进行冲洗,直至将骨内髓质完全洗脱为止。将洗脱的髓质均匀研磨,用滤网进行过滤,收集洗脱下来的骨髓细胞。

2、将制备的单细胞悬液500 g离心5 min,去上清,取沉淀。

3、将细胞沉淀用2 mL 溶血素进行重悬,室温反应10 min将红细胞进行裂解。

4、 500 g离心5 min,去上清,取沉淀。

5、加入2 mL PBS 将细胞沉淀进行洗涤,重悬后 500 g离心5 min,去上清,取沉淀。

6、用1 mL RPMI培养基,吹打混匀重悬细胞。

7、细胞按1:10或1:20倍稀释,进行细胞计数。

8、取5*106个淋巴细胞进行刺激,加入PMA、Ionomycin和Golgistop,37℃培养4 h。

9、刺激完成后,500 g离心5 min,弃上清。

10、加入5 mL PBS重悬细胞,500 g离心5 min,弃上清。

11、加入100 μL PBS重悬细胞,加入APC-CD4抗体1 μL,涡旋混匀,室温避光反应20 min。

12、每管加2 mL细胞固定液,室温避光孵育20 min,600 g离心5 min,弃上清。

13、每管加入2 mL细胞破膜液,室温避光孵育10 min,600 g离心5 min,弃上清。