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肿瘤细胞的血管形成实验——体外血管形成实验步骤

血管形成实验是测量在体外血管生成的一种快速的、可量化的方法。

一般做的比较多的是研究内皮细胞的血管形成。在体外,内皮细胞接种在一定基底上,易形成网状结构,可通过拍照观察计数对血管结果进行定量分析。

体外血管形成实验的研究基于研究认为肿瘤新生血管是一个有价值的治疗靶点,抗肿瘤新生血管研究已经成为肿瘤学中的一个研究热点,血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用。

在体内,血管生成是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成的新的血管,其对于机体器官生长、胚胎发育和伤口愈合在内的多个过程具有十分重要的作用。

肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程,包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。研究表明无论是原发性肿瘤还是继发性肿瘤,其直径一旦超过2 mm,都会有血管的生成,这是由于肿瘤细胞自身可分泌出多种生长因子,这些生长因子可以诱导血管的生成,抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移,因此体外血管形成实验广泛应用于抗肿瘤药物的研究中。

实验流程

血管形成实验流程示意图

实验流程图

耗材结构

血管形成实验载玻片截面示意图

血管生成载玻片截面示意图

Matrige铺在下孔,细胞铺在Matrige上,上孔充满培养基

实验步骤

我们将以小鼠动脉内皮细胞为例,对细胞血管形成实验进行简单阐述。

细胞血管形成实验操作步骤如下:

1. 基质胶准备:实验前一天将Matrigel置于冰盒中,放入4℃冰箱过夜,使胶能过夜缓慢融化。(注意:同样要准备一些4℃预冷的枪头用于吸取Matrigel);

2. 凝胶:第二天待matrigel冻融后,准备进行分装,matrigel用预冷枪头混匀,EP管提前预冷,每500uL分装,在操作过程中要将Matrigel始终保持放在冰盒中;

3. 铺胶:96孔板提前预冷,取50μL/孔Matrigel基质胶加入96孔板中,加入时避免产生气泡,置于细胞培养箱中60min待其凝固;

4. 收集细胞:加入1mL含EDTA的胰酶消化细胞,待消化完全后,加入含血清培养液终止消化,计数后用培养基重悬细胞并调整细胞密度为1-2×104个/mL;

5. 待胶凝固后,取出96孔板,每孔加入100μL细胞悬液,做好标记后放入细胞培养箱常规培养;

6. 细胞常规培养2h至24h期间在镜下观察并拍照;

7. 结果分析:100X显微镜下随机选取5个视野观察计数血管内皮细胞成管数量。成管率=实验组成管数量/对照组成管数量*100%。

体外血管形成过程镜检图

体外血管形成过程镜检图



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