抗体的概念

抗体(antibody)是由效应B细胞产生和分泌的蛋白质,它们能与抗原特异性结合。

抗体是“Y”型分子,由两条重链(H链)和两条轻链(L链)组成,抗原与“Y”顶端的抗原结合位点结合,每个抗体都能识别特定的抗原。抗体仅产生于脊椎动物的血浆等体液中。

抗体的种类

依据抗体Fc端的类型,将抗体分为以下5大类:

IgG:血液中最丰富的的抗体亚型,占人体免疫球蛋白的70%—75%,对有害物质具有解毒作用。

IgM:通常在血液中循环,占人体免疫球蛋白的10%,与抗原亲和力比IgG低,可通过与细胞表面受体结合,激活细胞通路。

IgA:在血清、鼻粘液、唾液、母乳和肠液中含量丰富, 占人体免疫球蛋白的10-15%。

IgD: 在人体免疫球蛋白中占比不到1%,功能尚不明确。

IgE:以分钟为单位存在,在人体免疫球蛋白中占比不到0.001%,主要与过敏相关。

抗体的制备

A.   多克隆抗体的生产:

将抗原和佐剂混合后注射到动物体内,引起动物产生并分泌高滴度的抗体,称作免疫。

在通过数月的免疫循环之后,采集动物血清并纯化其中的抗体。这种方法产生的抗体来自不同的B细胞克隆,产生的抗血清(antiserum)含有许多不同的能够对注射的抗原起反应的抗体,称为多克隆抗体。

用于生产多克隆抗体的动物有:大小鼠、仓鼠、兔、鸡、山羊、绵羊等。

B.   单克隆抗体的生产:

a.杂交瘤法:将多次免疫后的动物脾脏或淋巴结研磨获得能够产生抗体的B细胞,与动物的骨髓瘤细胞融合,得到的融合细胞池通过选择性培养基培养,得到了既能产生抗体又能体外无限增殖的杂交瘤细胞池,再通过有限稀释法获得单克隆抗体。整个过程通常需要3个月以上。

b.噬菌体展示法:噬菌体是一种感染细菌的病毒。与编码部分抗体的基因相结合的噬菌体是一种抗体噬菌体,其表面显示抗体片段,如Fab型或scFv型。抗体噬菌体文库是一个庞大的抗体噬菌体混合群体,可以与各种分子反应。在噬菌体展示法中,利用抗体与目标分子的亲和力从抗体噬菌体文库中选择针对目标分子的抗体。

流式抗体的选择

流式抗体的选择一定要满足抗体选择最基本的条件:目标蛋白特异性,反应种属以及应用实验。

流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中,尽量减少实验工序和过程,以保证实验的真实和准确性。因此在条件允许的范围内,建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。

流式抗体荧光标记的选择:如果实验中检测单一指标:不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。通常来说,PE最强,适用于弱表达抗原。FITC强度较弱,适用于强表达抗原,使用范围比较广。实验需根据检测的目标蛋白进行具体选择。如果同时检测多个指标:确认流式细胞仪能检测多少个通道:流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。

如:实验者同时检测三个指标,可以在图1中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记,FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记,以防止荧光的重叠和相互干扰,影响最后结果。因此,流式细胞仪的通道越多,同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。同型对照,是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色,相当于实验的阴性对照。同型对照选择与标记抗体同种属来源,同亚型,同荧光标记的抗体。比如:抗人的CD3的PE标记的抗体,小鼠的IgG2a。同型对照选择PE标记的小鼠的IgG2a。