细胞凋亡(Apoptosis) 是生物界广泛存在的一种现象,与其它的生命现象一样具有同等重要的生理学或病理学意义。尽管其最终结果也是导致细胞死亡,但其诱导因素、发生机制和过程及意义均明显不同于一般的病理性细胞死亡(即细胞坏死性死亡,简称细胞死亡) 。  细胞凋亡的形态特征与细胞坏死性死亡的形态特征不同。细胞坏死性死亡是被动的病理性死亡,其形态特征首先是膜通透性增加,细胞外型发生不规则变化,内质网扩张,核染色质不规则移位,进而线粒体及核肿张,溶酶体破坏,细胞膜破裂,胞浆外溢,这种死亡 过程常常引起炎症反应。细胞凋亡则是在某些因素的诱导下,由细胞内在的有规律的机制引起的,是主动的生理性细胞自杀。其特征是细胞首先变圆,随即与邻近细胞脱离,失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,线粒体无明显变化,核染色质浓缩成块并凝聚在核膜周边,胞膜内陷将细胞自行分割为多个有外膜包裹、内涵物不外溢的凋亡小体,后被吞噬细胞或邻周细胞所识别、吞噬。由于细胞凋亡过程不导致溶酶体破坏及胞膜破裂,没有细胞内容物外泄,故不引起炎症反应,在生理条件下,生物体内细胞存活与死亡是由自身发育阶段提供的遗传信息,或由邻近细胞和其微环境提供的信号决定的,其中包括细胞相互接触提供的信号以及周围环境中活性物质、激素等。

细胞坏死是极端的物理、化学因素或严重的病理性刺激引起的细胞损伤和死亡,是非正常死亡。长期以来细胞坏死被认为是因病理而产生的被动死亡,但是近期的研究表明,细胞坏死可能是细胞“程序性死亡”的另一种形式,具有包括引发炎症反应在内的重要生理功能。当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时,坏死作为凋亡的“替补”方式被采用。

细胞凋亡的检测方法有很多,下面介绍常用的形态学检测方法。

1.光学显微镜和倒置显微镜

凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染,形成致密质块,有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小,胞质致密、嗜酸性染色增强,并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在,凋亡细胞与周围细胞分离,不引起炎症反应。

本方法简便易行,但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难,常缺乏较为特征的指标,具有较强的主观性,重复性差。本方法可用于调亡现象的初步观察,作为分析指标之一。

1)未染色细胞:

凋亡细胞的体积变小、变形,全面皱缩,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体,凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

2)染色细胞:

姬姆萨(Giemsa)染色、瑞氏染色等:正常细胞核色泽均一;凋亡细胞染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态;坏死细胞染色浅或没染上颜色。

苏木素-伊红(HE)染色:细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色(凋亡细胞),正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。

2.荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有:Hoechst 33342,Hoechst 33258,DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。  

PI和Hoechst33342双标:

PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA(或RNA)结合。但DAPI不能通过正常细胞膜,Hoechst则为膜通透性荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色。

正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒;而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集。故PI着色为坏死细胞;亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞。

凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:

Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;

Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;

Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。

3.电子显微镜

虽然光学显微镜下可以看见胞膜起泡现象和凋亡小体,但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构,因此用光镜观察难以令人满意,而透射电镜可清楚地观察到细胞结构在凋亡不同时期的变化。电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最经典、最可靠的方法,被认为是确定细胞凋亡的金标准。

检测方法:

透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定,丙酮脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸枸椽酸电子又重染色,透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定,乙醇逐级脱水,CO2临界点干燥,真空喷金,扫描电镜观察。

结果评判:

可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

缺点:

1)只能定性,不能定量;

2)标本处理过程复杂,设备相对昂贵,对检查者的技术水平要求较高,不适于大批标本检测;

3)在组织切片上进行电镜观察时,有时凋亡很难与正常细胞有丝分裂相鉴别,因为两种情况下都可出现染色质浓聚。如同时进行荧光染色,可弥补电镜检查的不足。

4.流式细胞技术

流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射,分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标,细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。因此,只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。

细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解,导致小分子DNA漏出,核DNA含量下降,细胞荧光染色后作流式细胞仪分析,可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰(xub-G1峰,即AP峰--apoptotic peak),代表凋亡细胞。

细胞凋亡的形态学检测结果直观,至今仍是判定细胞是否发生凋亡的金标准,但观察凋亡细胞的形态特征耗时费力,不适于大量凋亡样本的检测。

Hoechst 染料

最初由 Hoechst AG公司发明。这是一家德国公司,创建于1863年,后来经过数次合并,变成了Sanofi-Aventis(赛诺菲)集团的子公司。它们所有的试剂都以数字编号命名,也就是说Hoechst 33342是该公司合成的的第33342种化合物。类似的染料一共有三种:Hoechst 33258、Hoechst 33342和 Hoechst 34580。33342和33258最常用,激发/发射光谱也比较接近。

三种染料都可在LUYOR-3410高强度紫外线灯发出的350nm左右的紫外光激发。都在461nm处发出蓝靛色荧光。未被结合的染料更大发射光在510到540nm之间。可被氙-氩灯或水银-氩灯或紫外线灯等激发光源激发。激发光和发射光之间的斯托克斯位移巨大,故可用于多染料多颜色荧光染色。Hoechst染料的荧光强度随着溶液pH升高而增强。

Hoechst染料溶于水和有机溶剂,如二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。浓度可高达10mg/mL.水溶液可在4℃避光保存至少6个月。长期储存于≤-20℃。Hoechst与DNA双链中的小沟(minor groove)结合,更倾向于富含A/T(腺嘌呤/胸腺嘧啶)的DNA链。虽然说它能与所有的核酸结合,但是富含A/T的双链DNA使荧光强度显著增强。Hoechst可穿过细胞膜,可结合于活细胞或固定过的细胞。因此可用于活细胞标记,Hoechst能与DNA结合,干扰DNA复制和细胞分裂,因此有致畸和致癌危险。使用和废弃需谨慎。

Hoechst 33342,也称bisBenzimide H 33342或HOE 33342。分子式为C27H28N6O•3HCl•3H2O,分子量为615.99,CAS Number 23491-52-3。 Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料,对细胞的毒性较低。Hoechst 33342染色常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33342也常用于普通的细胞核染色,或常规的DNA染色。Hoechst 33342的更大激发波长为346nm,更大发射波长为460nm;Hoechst 33342和双链DNA结合后,更大激发波长为350nm,更大发射波长为461nm。Hoechst 33342溶于水,溶解度可达20mg/ml。用于细胞核染色时,推荐的Hoechst 33342工作浓度为0.5-10μg/ml。Hoechst 33342对人体有害,请注意适当防护。荧光染料都存在淬灭的问题,建议染色后尽量当天完成检测。 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

DAPI染料:

DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole),是一种能够与DNA强力结合的荧光染料,常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜,它可以用于活细胞和固定细胞的染色。

当DAPI与双股DNA结合时,在荧光显微镜的紫外光源照射观察下,DAPI染剂在358nm(紫外线)处有一个更大吸收峰,并在461nm(蓝)处有一个更大发射峰,其发射光的波长范围含盖了蓝色至青绿色,因此在荧光显微技术中DAPI被紫外线照亮且被蓝或青色滤镜检出。DAPI也可以和RNA结合,但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果,其发射光的波长范围约在400nm左右。

DAPI可用于固定细胞染色,但是因为活细胞染色对DAPI浓度有严格要求,它很少被用于活细胞染色。DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合,因此DAPI对生物体而言,也被视为一种毒性物质与致癌物。然而在MSDS中它被标记为无毒。尽管DAPI没有显现出对E.coli的诱变性,它在机器制造商提供的信息上被认为是一种DNA诱变剂。由于DAPI可以掺入DNA螺旋中,它很有可能有底层的DNA诱变性,因此应小心配置和使用DAPI。