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10大窍门,教你提高RNA抽取高得率!

我们都知道,RNA提取过程中最重要的注意事项是防止RNA酶的污染导致实验失败,下面我们总结了一些实验技巧,以帮助提取更高质量的RNA。

总的来说做培养细胞的RNA提取比较容易,用普通的trizol(国内外均可),只要准备充分,操作的准确,这样提高RNA抽取高得率一般是没有什么问题的。

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RNA提取失败经验总结

1、环境污染影响RNA提取。皮肤携带的细菌霉菌等微生物及人体自然脱落下来的皮屑,都可能成为RNA酶的来源,从而影响RNA的提取。因此要培养良好的无菌操作习惯,预防微生物污染。

2、操作时勤换手套,戴手套口罩,冰上操作,动作迅速。最关键的一步也是决定RNA质量的一步是:离心后,出现分层,RNA在上清中,中间是DNA,下面是蛋白。这里一旦不留意,中间的DNA就会混入,从而影响RNA质量。这里要提一个小技巧,为了提髙RNA的质与量,离心后不要马上吸取含有RNA的上清液,而是移取中层的DNA和下层的蛋白。余下的下层油相(10%~15%),经短暂高速离心之后再吸取上清含有RNA的水相。其实这一技巧可用于所有的分层液相的实验,如酚抽提DNA的实验,回收胶中DNA的实验。

RNA提取

3、对于组织而言,研磨是关键之一。在提取组织样品时,就得充分研磨组织,等组织块成为粉末后再加入Trizol试剂。常用的研磨方法是液氮研磨法。研磨后离心去处沉淀,不要在细胞离心后马上加入Trizol试剂。因为成团的细胞加入Trizol试剂后,外围细胞先期施放出的大分子DNA,聚积成团,干扰成团里层细胞的裂解,即使用加样枪或针头反复吸取,也无法彻底打断已经成团的DNA。

RNA提取

研磨过程中有三个关键步骤:

研磨器皿高压灭菌烘干水汽后,-80放置过夜,预冷冻;

组织块的表面积尽可能大,切不可成球状,一旦用力研磨,球状的组织块极易飞出研钵;

加入足量的液氮让组织块完全冻透,一次将组织块研磨好。在没有冻透之前千万不能研磨,如一次没有研磨好,下一次研磨的效果就差,且第二次加入的液氮会将前一次所产生的干粉带出研钵,使其飞溅在研钵的四周。这一技巧同样可用于分离提取组织块的DNA或蛋白质。

4、使用Trizol试剂时,其中的一种成分能抑制RNA酶,所有RNA样品泡在Trizol试剂中是不可能被RNA酶消化的。但是,对样品的后续操作会要求用无RNA酶的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150的烘箱中烘烤4h。塑料器皿可以在0.5mol/L的NaOH中浸泡10min,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。

5、用0.01%的DEPC或Erasol水溶解RNA时,原则上是要根据沉淀的多少加入相应的体积,考虑到新手一开始经验不足,可以少加,浓度大可以再稀释。提取完RNA后跑电泳检查有无DNA污染和RNA降解,然后-80保存。实验后要注意:超净台需用70%乙醇擦拭,再用DEPC或Erasol除去空气中的RNase,提取RNA所需的Tip和EP管要提前用0.1%的DEPC或Erasol水处理以除去RNase,DEPC处理还需高压。其实RNA贮存在70%的乙醇中,远远要比贮存于DEPC水中稳定,在-80可保存数年,有些甚至10多年后还可以用。

RNA提取

有两种操作方式:

乙醇或异丙醇沉淀后如不马上要用,直接换成70%乙醇,-80保存,用时再来分析RNA的质量和数量;常规的处理后,了解RNA的质和量,再加入3倍体积的无水乙醇,再-80保存。

当然,这两种贮存方式都要在RNA不是马上要用的前提下进行。如果提取的RNA比较多,可以先留取一部分样品进行马上进行的实验,另一部分贮存于70%乙醇,以备后用。

6、Trizol试剂提取RNA所用到的一次性试管要确保没有破损,能够耐受12000g的离心力。

实验用水相当重要,必须用DEPC处理过的无RNase水。配制过程是在去离子水中加入0.1%的DEPC,摇过夜之后,高压分解残留DEPC。。提取时,所有与Trizol试剂有过接触的器皿都要泡存水中,吸取出来的Trizol试剂也要直接加入含有大量水的玻璃杯中。

7、Trizol提取RNA时要注意戴手套和护眼罩,因为Trizol试剂含有酚等有机溶剂。操作要在通风橱完成,避免人呼吸道吸入。同时温度应该控制在15-30。

RNA抽提的10大窍门

1、快速組止Rnase活性。样品收集后快速冷冻,裂解时快速操作灭活Rnase。

2、选擇合适的抽提方法。高核酵含量的绝织,脂肪组织最好用含苯酚的方法。

3、预判质量要求。Northern,cDNA文库构建对完整性要求高,RT-PCR,RPA(Ribonucleaseprotectionassay)对完整性要求不是很高。RT-PCR对纯度(酵抑制物残留)要求很高。

4、彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。

5、检查RNA的完整性。电泳28S:18S=2:1是完整的标志,1:1对大部分实验也是可以接受的。

6、去除DNA。用于RT-PCR,arrayanalysis最好用Dnase丨去除DNA。

7、降低外源酶的污染。不能从外面又导入酶。

8、低浓度的核酸浓缩时,要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及DNA污染。

9、彻底溶解RNA,必要时可以65℃加热5分钟。

10、合适的保存方法。短时间可以-20℃保存,长期请保存于-80℃。

提高RNA得率的方法

1、使用更有效的破碎/匀浆方法。RNA如果不能被有效释放出来,得率是会降低的。液氣捣碎、酵消化破壁(Lysozyme/Lyticase)、电动匀浆器匀浆,虽然麻烦,但都是获得高得率的有效手段。

2、抽提试剂的更换。假如得率低不是由匀浆方法不彻底引起,则可能是所使用的试剂的裂解能力差导致。最合理的做法是:使用更多的裂解液;用完后换厂家。另外,可以改用不使用苯酚、氯仿提取的试剂方法;使用苯酚、氛仿抽提的方法,由于不可能全部取出上清,RNA的损失是比较大的。

3、延长沉淀时间。如果核酸浓度低,采取低温沉淀、并延长沉淀时间,可以获得非常好的效果。

RNA提取过程中最应该注意的就是RNA酶的防止,所有操作在超净台完成,然后一定要带一次性手套,而且一直要换。按规程操作,提高RNA高得率不是问题。

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