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荧光定量PCR到底有什么用?

做为科研领域的人,没有谁不知道PCR。它是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。

这个由美国科学家Mullis在1985年发明的聚合酶链反应,至今在世界范围内都有广泛的应用,作为生物学实验的一个重要的方法,其有着不可估量的作用。

什么是定量PCR?

我们知道,DNA有着双螺旋结构,当温度达到95摄氏度时,双链的DNA会分解成为单链状态,而在温度到达72摄氏度左右时,DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖的方向进行合成。聚合酶链反应PCR就是通过不断地调节温度,以数量级的速度增加DNA数量的方法。

而实时荧光定量PCR是指,在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。

实时荧光定量常用的荧光化学分类有染料法和探针法。其中,探针法可以更加精确地对需要检测的DNA片段进行染色,一般情况下,探针法的特异性更高。

荧光定量PCR的价值

事实上,大多数病毒在首次感染动物以后,会在感染后的7天左右产生特异性抗体。此后,当同种病毒再次入侵时,机体会迅速的产生高水平抗体,以中和这些病毒。这个过程被称为机体的特异性免疫反应。

特异性免疫示意图


依照生物体的这个特点,一般情况下,科学家会采用PCR或酶标进行实验检测。但也有意外,比如目前国内较为流行且对养猪业造成惨重损失的“非洲猪瘟病毒”,该病毒的自然宿主只有家猪,野猪,钝缘软蜱,但除猪只本身之外,人、车、物、料、等环境中携带有非洲猪瘟病毒都会造成非洲猪瘟的传播,进而威胁到猪群的安危。

非瘟病毒传播途径


更为可怕的是,这种病毒侵入猪只体内后,猪只在产生抗体之前就会走向死亡,死亡率高达90%~100%,自2018年非洲猪瘟进入中国以来,将近一年时间,对我国畜牧业造成了上百亿的损失。此时,由于酶标法检测的是动物产生抗体后的感染情况,显然,对待这种烈性病毒来言,其价值远远低于荧光定量PCR。

抗体示意图


荧光定量PCR有着高灵敏性、高精确度、方便省时等特点,他可以在短时间内,将一个微量的特种DNA扩增到一个足以监测到的数量级。由于在体内达到一定数量级会造成生物体死亡,这相当于是在和动物体内的病毒赛跑,以达早发现,早处理的效果。

传统的荧光定量PCR检测应用的局限性

虽然,PCR技术已经相当成熟,但一般情况下,都需要一些相对高精尖的实验设备。对于一个高精尖的传统实验室,不但要满足满屋高科技的实验设备,合理的空间布局等基本条件,一般还具有人员素质专业性高(本科或硕士以上)、管理严谨度高(实验管理等SOP)、投入成本高(国家或者企业投资)、结果责任性高(对结果具有法律效力)等特点。

由于相对苛刻的条件,PCR实验室想要渗透到多有生物相关行业内部难度相当大。

在PCR技术被发明后的30余年里,世界范围内的不少科学家都对PCR技术的发展做出了贡献。目前,应用最广泛的实时荧光定量PCR由美国Applied Biosystems 公司在1996年推出。事实上,但从技术层面讲,现有的PCR技术已可以满足当下的市场需求,但PCR检测所需要的条件和昂贵的实验器材导致了并不是所有行业都有机会普及使用。


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