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免疫组化(IHC)实操技巧!

一提到免疫组化(IHC)实验,繁琐的操作步骤总是叫人头疼。实际IHC 实验并不算难,但由于操作步骤较多,因此造成影响实验结果的因素较多,可谓是稍有疏忽就全盘皆输,可以用九九八十一难来形容了。但也不是没有办法解决,现在我们就将免疫组化操作中常见问题和解决方法汇总给大家,希望能帮助到你。

免疫组化实验技巧海报.jpg



No.1

切片染色深



问题原因:一抗浓度过高是造成切片染色深常见的原因之一。

解决方法:是在每次使用新抗体前对其工作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到适合自己实验室的理想工作浓度,包括即用型的抗体也同样需要进行测试,不能只简单的按照说明书进行染色。


No.2

时间过长或温度过高影响实验结果



问题原因:忽视操作规程,没有严格控制时间,因遗忘而造成时间延长或温度过高。

解决方法:实验人员应当严格执行操作规程,随身佩带报时表或报时钟,及时提醒。现在流行的二步法敏感性很高,要求一抗孵育的时间不是传统的 1 小时,而是 30 分钟,因此,要根据染色结果进行调整。


No.3

DAB显色不理想



问题原因:DAB 变质或显色时间太长。

解决方法:DAB 最好现用现配,如有沉渣,应进行过滤后再使用。当染色片太多或使用染色机,导致无法及时进行终止操作时,也应该尽量对新的,或使用频率不高的抗体,进行显色时的监控,避免显色时间过长。

配制好的 DAB 不应存放时间太长,因为在没有酶的情况下,过氧化氢也会游离出氧原子与 DAB 产生反应,从而降低 DAB 的效力;像未用完的 DAB 存放在冰箱里,需要的时候再取用的这种行为也是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控,待达到理想的染色程度时,应立即终止反应。


No.4

组织变干



问题原因:修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因

解决方法:实验人员在操作过程中要做到仔细认真,并采用 DAKO 笔或 PAP Pen 在组织周围画圈,达到有效的避免液体流失,提高操作速度的效果。


No.5

切片背景着色



问题原因:切片在缓冲液或修复液中浸泡时间大于 24 小时,并切放置在室温下,特别是炎热的夏天,就会出现背景着色。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复,第二天加抗体进行免疫组化染色,如果将装有切片和修复液的容器放在 4oC 冰箱过夜,对结果无明显影响。

解决方法:室温下不可存放时间太长,尤其是夏天。切片和修复液如需过夜,最好存放在 4oC 冰箱内。


No.6

切片不显色或者背景着色



问题原因:一抗变质、质量差的多克隆抗体,是导致切片不显色或者背景着色的主要原因。

解决方法:一定要注意一抗的有效期,用新买抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。


No.7

 非特异性染色



问题原因:忘记血清封闭,在免疫组化中使用封闭血清,可以消除非特异性染色,提高目的蛋白的准确性和降低背景。

解决方法:封闭血清一般选择和二抗来源相同的,因此常用山羊血清。有时也会使用小牛血清、BSA、羊血清等,但不可与一抗来源相同。


No.8

操作过程中脱片



(1)可能是黏附载玻片质量的问题,建议尝试更换载玻片。

(2)组织切的不好,可能是切片机刀片较钝造成切片切的厚、不均匀,或者是切片机操作者手法不熟练等。

(3)可能是组织的问题,比如癌症组织有坏死情况时,也容易造成脱片。

(4)烘烤结果不理想,可能是烘烤时间较短或温度不够等。

(5)操作时甩动幅度过猛,有脱片嫌疑的切片最好不甩或轻轻甩,可用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

(6)修复过程出现问题,比如在抗原修复时,高压时间过长,或者放进 100 度修复液时不够平稳,也容易出现脱片的情况。此外,用 EDTA 修复比柠檬酸更容易脱片。

(7)一旦见到有组织漂起来,在操作时就要更加谨慎,使用 PBS 的时候尽量泡,不要冲。



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