真核生物mRNA测序的研究对象为特定细胞或组织在某一功能状态下转录出来的mRNA集合,通过oligo-dT磁珠捕获带polyA尾的RNA进行建库测序,也称为PolyA-Seq。可研究mRNA差异表达或检测结构变异,筛选与疾病或性状相关的分子标记;还可揭示转录组的复杂性,确定基因以及转录本结构、可变剪接、RNA编辑、带polyA尾的非编码RNA 和新转录本。目前已广泛应用于基础研究、分子育种、临床诊断和药物研发等领域。

• Total RNA提取:根据不同的样品类型采用不同的提取方案,获得高质量的Total RNA。

• RNA质量检测:Nanodrop检测RNA样品浓度及纯度;琼脂糖凝胶电泳及Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA样品完整性。

• mRNA捕获:采用oligo-dT磁珠捕获带Poly A结构的mRNA

• RNA片段化:采用mg2+离子打断的方法,将RNA片段化至200-300bp。

• cDNA合成:随机引物反转录合成cDNA第一链;在合成cDNA第二链时掺入dUTP标记第二链,保留了RNA的链方向性(可选)。

• 加A尾,接头连接:cDNA两端引入接头序列及标记样品的index序列。

• PCR富集:PCR富集文库片段,文库大小为300-400bp。

• 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布,Qubit 3.0或荧光定量PCR测定文库浓度。

• 上机测序:根据数据量要求将文库pooling上机测序。

• 数据分析:下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析,提供全面数据分析报告。

样品要求

• 样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品。

• 样品量:细胞样品请提供至少1×106个细胞,组织样品请提供至少100 mg的组织块或切片,RNA样品请提供5 μg以上的总RNA。

• 样品质量:RNA无明显降解,提取的总RNA,OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度≥500 ng/μL,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥ 7。

• 样品保存:

    细胞样品:收集细胞至RNase Free 1.5 mL EP管,弃去培养基,用PBS洗一次,弃去PBS,把细胞沉淀保存在-80℃。

    组织样品:组织样品离体后放在冻存管中,迅速置于液氮下速冻1分钟以上,然后保存在-80℃。

    RNA样品:可将RNA溶于RNase Free 的超纯水中,-80℃保存。

    样品保存期间避免反复冻融。

• 样品运输:样品置于1.5 mL管中,封口膜封好,干冰运输。

测序方案

测序模式 PE150

测序数据量 10Gb clean data

生物信息分析内容

1 原始数据质控检查

2 比对结果质控检查

3 基于基因表达的样品主成分分析

4 差异基因表达分析

5 差异基因GO功能分析

6 差异基因通路分析

7 变异剪切分析 (40M pair end reads)

8 基因突变分析(40M pair end reads)

9 转录调控活性分析及通路互作分析