16S rDNA是原核生物编码16S rRNA的基因,长度约为1500bp,由10个保守区和9个可变区(V1-V9)组成,可变区反映了物种间的差异性。16S rDNA-seq是通过提取微生物菌群的DNA,选择可变区的特定区段(V3-V4)进行PCR扩增,再通过高通量测序的方法,帮助研究人员分析特定环境中微生物群体基因组成及功能、微生物群体的多样性与丰度,进而分析微生物与环境、微生物与宿主之间的关系,发现具有特定功能的基因。在医学领域,主要应用于肠道微生物与疾病的关联分析,揭示疾病与健康个体间微生物的差异,研究药物或饮食干扰后菌群差异,或某一病程发展过程中肠道菌群的变化,如结直肠癌等。

技术路线

• 宏基因组DNA提取:根据不同的样品类型采用不同的提取方案,获得高质量的宏基因组DNA。

• DNA质量检测:Nanodrop检测DNA样品浓度及纯度;琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品完整性。

• 16s可变区PCR扩增:引物设计扩增可变区的特定区段(V3-V4区)。

• 第二次PCR扩增:在DNA分子两端引入接头序列及index序列。

• 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布,Qubit 3.0或荧光定量PCR测定文库浓度。

• 上机测序:根据数据量要求将文库pooling上机测序。

• 数据分析:下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析,提供全面数据分析报告。

样品要求

• 样品类型:Meta样品,如粪便、土壤等或Meta DNA样品。

• 样品量:Meta样品请提供2 g以上,DNA样品2 μg以上。

• 样品质量:DNA无明显降解,无蛋白污染,OD260/280值≥1.5,OD260/230值≥1.0,浓度≥30 ng/μL。

• 样品保存:DNA样品:可将DNA溶于Nuclease Free 超纯水中,-20℃保存。样品保存期间避免反复冻融。

• 样品运输:样品置于1.5 mL管中,封口膜封好,冷冻运输。

测序方案

测序模式 Miseq PE300

测序数据量 0.05M clean reads

生物信息分析内容

基础分析  

1 原始数据处理及统计;

2 可变区域验证;

3 操作分类单元(OTU)聚类及分析;

4 单样本物种分类及丰度分析;

5 多样品物种丰度分析;

6 Alpha多样性分析

7 Beta多样性分析

高级分析 

8 样品差异主要因子分析;

9 组间显著性差异分析;

10 系统进化树构建;

11 个性化分析