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大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α)酶联免疫试剂盒本试剂盒仅供研究，不用于临床诊断.样品请保留备份并且先做预实验
目录 1. 实验原理 2. 试剂盒组成 3. 试剂盒保存 4. 需要而未提供的试剂和器材 5. 试剂准备 6. 样本前处理 7. 洗板方法 8. 详细操作程序 9. 操作总结 10. 性能参数
1.实验原理：本试剂盒采用竞争法检测样本中肿瘤坏死因子-α（TNF-α) 的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入生物素标记的识别抗原，在37℃下孵育30min，两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原，然后加入亲和素-HRP，在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合，洗涤后结合的HRP催化TMB（四甲基联苯胺）成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关
2.试剂盒组成：
备注： a． 试剂盒中“标准品/样品稀释液”为超纯水（可用双蒸水替代），“终止液”为2M的H2SO4，洗涤液为含0.15%吐温-20的PBST，如不够可自行配制。 b.不同公司的缓冲体系存在较大差异，请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果。 c.浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出，稍微加温后即会消失，不影响使用。 d. 浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP稀释前务必先离心同时应避免反复冻融 3.试剂盒保存 本试剂盒可以在2-8℃下保存6个月，在-20℃下可以保存更长的时间。酶标板为真空包装，板条可以拆卸，拆开以后如一次不能用完，请放入提供的密封袋中，放入干燥剂，2-8℃保存，在一个月之内仍然有效。试剂不能反复冻融。 4．需要而未提供的试剂和器材 1． 37℃恒温箱。 2． 标准规格酶标仪。 3． 精密移液器及一次性吸头 4． 双蒸水或超纯水 5． 干净的试管或Eppendof管 6． 吸水纸 7． 自动洗板机或8道排枪 8． ELISA数据处理软件，推荐使用ELISACalc 9． 500ml烧杯的和适当量程的量筒 5试剂准备 a. 使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。 b. 本试剂盒可以直接加样，如浓度过高，可以进行适当比例的稀释（推荐2-5倍稀释），计算时应将结果乘以稀释的倍数。 c. 洗涤液为25倍浓缩液，使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中，用双蒸水定容到500ml即为工作液。 d. 标准品的稀释：先用标准品/样品稀释液将标准品冻干粉定容到150μl，然后漩涡混匀30秒即为标准品原液（24小时内用完）。取5支干净的Eppendorf管，每管加150μl的标准品稀释液，分别标记上640ng/L,320ng/L,160ng/L,80ng/L ,40ng/L .取150μl标准品原液加入标640ng/L 的管中，混匀后同样取出150μl，加入下一管，以此类推直至最后一管。零孔：直接加标准品/样品稀释液。（见下图）
原液1280ng/L 640ng/L 320ng/L 160ng/L 80ng/L 40ng/L e.生物素抗原的稀释：抽取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中，漩涡混匀15秒至冻干粉完全溶解，然后将所有液体移入稀释液瓶中,再次漩涡混匀30秒即为生物素抗原工作液。 f.亲和素-HRP的稀释：低速离心（使浓缩液全部沉到管底），将浓缩亲和素-HRP全部移入相应稀释液中然后漩涡混匀30秒即为亲和素-HRP工作液。 6样本前处理 a.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 7洗板方法 a. 手工洗板：先洗去酶标孔中的的液体，在吸水纸上拍干，然后每孔加入300μl稀释好的洗涤液，轻轻摇晃30秒，然后甩掉，在吸水纸上拍干，重复4-5次。 b. 洗板机洗板：洗板机洗板比较便捷，但应操作熟练后使用。 8详细操作程序 a. 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。 b. 空白孔不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。 c. 标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必须要做，并将其作为标曲的最后一个点)。 d. 样品孔：加入样品50μl（推荐直接加样，浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍），然后加入生物素抗原工作液50μl。 e. 轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。 f. 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。 g. 第一次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 h. 加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。 i. 第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 j. 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。 k. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色). l. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。 m. 计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线（四参数）。标曲示意图如下：
9操作总结 准备试剂，样品和标准品
计算 10性能参数 a. 批内差：CV＜10% b. 批间差：CV＜12% c. 灵敏度：5ng/L d. 保存： 2-8℃ e. 规格： 48T/盒 f. 有效期： 6个月（2-8℃）。
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产品编号 MD120490
本试剂盒仅供研究，不用于临床诊断.样品请保留备份并且先做预实验
目录 1. 实验原理 2. 试剂盒组成 3. 试剂盒保存 4. 需要而未提供的试剂和器材 5. 试剂准备 6. 样本前处理 7. 洗板方法 8. 详细操作程序 9. 操作总结 10. 性能参数 1.实验原理：本试剂盒采用竞争法检测样本中肿瘤坏死因子-α（TNF-α) 的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入生物素标记的识别抗原，在37℃下孵育30min，两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原，然后加入亲和素-HRP，在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合，洗涤后结合的HRP催化TMB（四甲基联苯胺）成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关 2.试剂盒组成：
备注： a． 试剂盒中“标准品/样品稀释液”为超纯水（可用双蒸水替代），“终止液”为2M的H2SO4，洗涤液为含0.15%吐温-20的PBST，如不够可自行配制。 b.不同公司的缓冲体系存在较大差异，请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果。 c.浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出，稍微加温后即会消失，不影响使用。 d. 浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP稀释前务必先离心同时应避免反复冻融 3.试剂盒保存 本试剂盒可以在2-8℃下保存6个月，在-20℃下可以保存更长的时间。酶标板为真空包装，板条可以拆卸，拆开以后如一次不能用完，请放入提供的密封袋中，放入干燥剂，2-8℃保存，在一个月之内仍然有效。试剂不能反复冻融。 4．需要而未提供的试剂和器材 1． 37℃恒温箱。 2． 标准规格酶标仪。 3． 精密移液器及一次性吸头 4． 双蒸水或超纯水 5． 干净的试管或Eppendof管 6． 吸水纸 7． 自动洗板机或8道排枪 8． ELISA数据处理软件，推荐使用ELISACalc 9． 500ml烧杯的和适当量程的量筒 5试剂准备 a. 使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。 b. 本试剂盒可以直接加样，如浓度过高，可以进行适当比例的稀释（推荐2-5倍稀释），计算时应将结果乘以稀释的倍数。 c. 洗涤液为25倍浓缩液，使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中，用双蒸水定容到500ml即为工作液。 d. 标准品的稀释：先用标准品/样品稀释液将标准品冻干粉定容到150μl，然后漩涡混匀30秒即为标准品原液（24小时内用完）。取5支干净的Eppendorf管，每管加150μl的标准品稀释液，分别标记上640ng/L,320ng/L,160ng/L,80ng/L ,40ng/L .取150μl标准品原液加入标640ng/L 的管中，混匀后同样取出150μl，加入下一管，以此类推直至最后一管。零孔：直接加标准品/样品稀释液。（见下图） 原液1280ng/L 640ng/L 320ng/L 160ng/L 80ng/L 40ng/L e.生物素抗原的稀释：抽取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中，漩涡混匀15秒至冻干粉完全溶解，然后将所有液体移入稀释液瓶中,再次漩涡混匀30秒即为生物素抗原工作液。 f.亲和素-HRP的稀释：低速离心（使浓缩液全部沉到管底），将浓缩亲和素-HRP全部移入相应稀释液中然后漩涡混匀30秒即为亲和素-HRP工作液。 6样本前处理 a.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 7洗板方法 a. 手工洗板：先洗去酶标孔中的的液体，在吸水纸上拍干，然后每孔加入300μl稀释好的洗涤液，轻轻摇晃30秒，然后甩掉，在吸水纸上拍干，重复4-5次。 b. 洗板机洗板：洗板机洗板比较便捷，但应操作熟练后使用。 8详细操作程序 a. 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。 b. 空白孔不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。 c. 标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必须要做，并将其作为标曲的最后一个点)。 d. 样品孔：加入样品50μl（推荐直接加样，浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍），然后加入生物素抗原工作液50μl。 e. 轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。 f. 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。 g. 第一次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 h. 加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。 i. 第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 j. 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。 k. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色). l. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。 m. 计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线（四参数）。标曲示意图如下：
9操作总结 准备试剂，样品和标准品
加入准备好的样品和标准品，生物素抗原，37℃反应30分钟
洗板5次，加入亲和素-HRP，37℃反应30分钟
洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10分钟
加入终止液
10分钟之内读OD值
计算 10性能参数 a. 批内差：CV＜10% b. 批间差：CV＜12% c. 灵敏度：5ng/L d. 保存： 2-8℃ e. 规格： 48T/盒 f. 有效期： 6个月（2-8℃）。
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