1.1.融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。将2X PCR Master Mix置于冰浴上或冰盒内。

1.2.参考下表在冰浴上设置PCR反应体系：

*对于不同类型的模板在50μl反应体积中推荐用量如下：

哺乳动物基因组DNA：0.1-1μg；大肠杆菌基因组DNA：10-100ng；质粒DNA：0.1-10ng。过多的模板DNA容易导致非特异性的PCR产物。

1.3.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。

1.4.如果所使用的PCR仪有热盖则省略本步骤。如果PCR仪没有热盖，则在管内滴入一滴矿物油(mineral oil，ST275)。

1.5.把设置好的PCR反应体系置于PCR仪上，开始PCR反应。

2.注意：

1.PCR反应的设置需根据模板、引物、PCR产物的长度和GC含量等条件的不同设定不同的PCR反应条件包括温度、时间和循环数等。

2.STEP4(延伸)的时间设置需根据PCR产物的长度进行设置，通常每kb产物的延伸时间为1分钟。例如PCR产物的长度为1kb，则延伸时间可以设置为1分钟，PCR产物的长度为2kb，则延伸时间可以设置为2分钟，以此类推。

3.对于初次进行的PCR，为尽量确保可以扩增出预期的PCR产物，可以把循环数设置为35。对于需进行半定量或定量的PCR反应循环数一定要进行适当优化，使PCR反应没有达到平台期。